黏病毒抗性蛋白A(MxA)通过增强干扰素刺激应答元件(ISRE)活性诱导HepG2细胞干扰素刺激基因表达

目的研究黏病毒抗性蛋白A(MxA)对HepG2细胞Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)途径的影响。方法采用pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2细胞,免疫荧光细胞化学染色检测MxA蛋白在HepG2细胞的表达和定位,Western blot法检测MxA蛋白表达;采用MxA小干涉RNA(si-MxA)转染HepG2细胞并以α干扰素(IFN-α)处理细胞,实时荧光定量PCR检测HepG2细胞黏液病毒抗性蛋白A(MxA)、蛋白激酶R(PKR)和寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的mRNA表达,Western blot法检测MxA、PKR、OAS、细胞信号转导子与转录激活子1(STAT1)、磷酸化的STAT1(p-STAT1)、STAT2、p-STAT2和干扰素调节因子9(IRF9)的蛋白表达。此外,pcDNA3.1-Flag-MxA与pISRE-TA-luc分别共转染至HepG2和HepG2.2.15细胞,荧光素酶活性检测干扰素刺激应答元件(ISRE)活性。结果MxA蛋白在HepG2细胞质和细胞核均有表达且细胞质表达量高于胞核。敲低HepG2细胞中MxA表达虽不影响IFN-α诱导的STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2和IRF9蛋白的表达,但显著降低抗病毒蛋白PKR和OAS的表达。过表达MxA的HepG2细胞ISRE活性增强且PKR和OAS蛋白表达增高,但这种效应却在HepG2.2.15细胞中被抑制。结论MxA通过增强JAK/STAT信号通路ISRE活性诱导抗病毒蛋白表达。

丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对干扰素刺激应答元件的影响

目的探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus,HCV)1b基因型(genotype 1b,GT-1b)C区氨基酸(amino acid,aa)70替代对干扰素刺激应答元件(interferon-stimulated response element,ISRE)的影响。方法首先构建HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,测序鉴定后瞬时转染肝瘤细胞系Huh7细胞,Western blot法鉴定HCV核心蛋白的成功表达;然后利用ISRE双荧光素酶报告基因实验检测核心蛋白表达对ISRE活化的影响,并以SYBR Green real-time PCR检测3种主要干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的表达情况。结果构建了HCV aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒,并在体外培养细胞中成功表达。但野生型和变异型核心蛋白表达对ISRE活化及3种主要ISGs表达的影响无明显差异。结论单纯R70Q/H变异的核心蛋白似乎并不足以直接导致IFNα耐药。

干扰素刺激应答元件介导IFN-α-2b对IFP35的转录调控

IFP35为分子量35 kDa的干扰素诱导蛋白,可以被Ⅰ型干扰素诱导表达,但是其受干扰素调控机制未知.为了阐明Ⅰ型干扰素对IFP35的转录调控机制,克隆了IFP35基因翻译起始点上游242 bp(-359～-118)的序列,将之置于萤火虫荧光素酶基因上游,构建报告质粒pGL-359,瞬时转染实验证实,该段序列具有启动子活性;序列分析表明其为GC box型启动子,-181～-170 bp序列符合干扰素刺激应答元件(interferon stimulate response element,ISRE)特征.用IFN-α-2b处理细胞后,pGL-359活性可提高达3.1倍,但突变pGL-359上的ISRE特征序列后,该突变启动子不再响应IFN-α-2b刺激.随后的凝胶电泳阻滞实验发现,用IFN-α-2b处理HeLa细胞后,其核蛋白可与IFP35启动子上的ISRE元件形成明显的阻滞带,表明ISRE介导了IFN-α-2b对IFP35的转录调控.

猪圆环病毒2型基因组中干扰素刺激应答元件对体外干扰素介导的猪圆环病毒2型复制增强效应的影响

猪圆环病毒2型是猪的一种重要病原。有证据显示,使用γ-干扰素或α-干扰素对PCV-2感染细胞进行处理,可以增强体外PCV-2的复制,经鉴定干扰素刺激应答元件(ISRE)样序列存在PCV-2的基因组中。为了确定ISRE是否与病毒对IFNs的响应有关,构造一些经ISRE序列系列突变而来的ISRE突变体。用γ-干扰素或α-干扰素对ISRE突变体感染细胞进行处理,结果显示由ISRE序列引起的相关病毒复制增强现象逐渐消失。为了确定ISRE是否是IFN介导的PCV-2复制增强的充足和必要条件,在荧光报告基因检测系统中对包含有ISRE基因启动区重复基因的野生型PCV-2及ISRE突变的PCV-2的DNA片段进行检测,分别用γ-干扰素或α-干扰素处理被报告基因结构转染的3D4/31细胞。结果显示,与经IFN处理后的ISRE突变PCV-2和野生型PCV-2样品相比,没有处理的ISRE突变PCV-2和野生型PCV-2对照有更高水平的荧光活性,表明从整个病毒基因组中移除ISRE样序列后,其活性消失。另外,无论是何种突变,用IFNs处理后启动子活性逐渐消失,这表明在调节ISRE介导的基因转录过程中还需要病毒基因组中的其它顺式元件。结论:当PCV-2 ISRE样序列存在于完整病毒中而不是分离毒株中时,其能在体外影响干扰素介导的PCV-2复制增强。