RNAi非特异效应的干扰素反应探讨

背景与目的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一项针对转录后特异序列基因沉默的技术,可用于调控基因表达和研究基因功能。但该技术引发的非特异效应也越来越受到重视。其中,干扰素反应为RNAi非特异效应的主要类型之一。本文拟探讨在RNA干扰实验中干扰素反应的检测。方法在A549人肺癌细胞株中应用基因转染技术研究5个不同的FLJ20420 siRNA对FLJ20420基因沉默情况;应用real-time PCR和基因芯片技术相结合,分别检测经2个不同FLJ20420-siRNA干扰后A549细胞中干扰素激活基因(ISGs)表达谱的变化情况。结果①在A549细胞中,5个不同的FLJ20420-siRNA可不同程度地对目的基因起到沉默作用,其中FLJ20420-siRNA-1和FLJ20420-siRNA-4两个的沉默效果最佳,分别为80%和90%;②应用real-timePCR检测与干扰素反应激活相关的16个主要标志性基因发现,A549-FLJ-siRNA-1细胞中有14个基因的表达明显上调;而A549-FLJ-siRNA-4细胞中仅有2个基因的表达变化差异具有显著性,提示在A549-FLJ-siRNA-1细胞中发生了RNAi的非特异性效应;③基因芯片分析发现在A549-FLJ-siRNA-1细胞中有51个干扰素激活基因(ISGs)表达上调2倍以上(P<0.05),而在A549-FLJ-siRNA-4细胞中仅有6个干扰素激活基因(ISGs)表达上调2倍以上(P<0.05),从而证实了A549-FLJ-siRNA-1细胞中存在RNAi的非特异性效应干扰素反应。结论在进行RNAi实验时,siRNA不仅能针对目的基因产生沉默效果,也可同时诱发干扰素反应。应用real-time PCR对于主要的干扰素激活基因(ISGs)的mRNA表达变化的检测将有助于发现RNAi非特异效应干扰素反应。

鱼类干扰素反应及分子调控

干扰素反应在脊椎动物抵抗病毒感染过程中发挥重要作用。近年来,鱼类干扰素抗病毒免疫反应的研究取得了重要进展,不仅克隆鉴定了一系列鱼类干扰素系统基因,而且通过功能研究揭示了鱼类具有类似于高等哺乳类的干扰素反应。但是,鱼类干扰素反应及分子调控具有自身特点。以下综述了最近这方面的研究结果。

高龄血液病患者口服新癀片防治干扰素副反应的疗效观察

目的 观察长期应用干扰素的高龄血液病患者口服新癀片对抗干扰素发热副反应的疗效。方法 将 5 0例长期皮下注射干扰素的高龄血液病患者按注射前 30min、注射时及注射后 30min口服新癀片分为 3组 ,观察患者注射干扰素前、后体温的变化。结果 高龄血液病患者应用干扰素前 30min服用新癀片体温控制理想 ,无并发症发生。结论 应用干扰素前 。

采用干扰素释放反应试验和PPD皮试对深圳市高校学生结核分枝杆菌潜伏感染筛查的研究

目的采用结核分枝杆菌特异性IFN-γ免疫酶联斑点法(ELISPOT)和传统的结核菌素皮试(PPD皮试)对深圳市高校学生结核分枝杆菌潜伏感染现状进行筛查,并比较两种方法的差异。方法采用自主研制的Elispot试剂盒(简称Elispot)和PPD皮试,对133例健康志愿者进行平行检测。结果A高校99例志愿者中PPD皮试有49例阳性(49.5%),Elispot检测有20例阳性(20.2%);B高校34例志愿者中PPD皮试有27例阳性(79.4%),Elispot检测有2例阳性(5.9%)。对两种方法进行平行比较分析,结果有统计学差异(χ2=41.31,P<0.005);在PPD()组中Elispot阳性率最高为28.57%;在()-(-)组中分别为22.2%、12.5%及12.28%。结论结核菌特异性IFN-γElispot试剂盒在健康人群中检测阳性率比传统的PPD皮试要低,在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值优于PPD皮试,在结核分枝杆菌潜伏感染早期诊断有较好的发展前景。

肺结核患者环腺苷酸反应元件结合蛋白与Y-干扰素基因启动子区的关系

目的研究活动性肺结核患者环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）与Y-干扰素基因近端启动子的关系。方法2007年1—12月北京胸科医院结核科收治的25例肺结核患者（肺结核组）和18例PPD阳性健康人（对照组）为研究对象。分离外周血中CD3＋T细胞，采用凝胶电泳迁移率变化（EMSA）和竞争性EMSA分析CREB及Y-干扰素基因近端启动子结合情况，染色质免疫共沉淀（ChIP）技术研究MTB抗原在体内状态下能否诱导CREB产生并与Y-干扰素基因近端启动子结合。Westernblot法检测CREB表达水平及MTB抗原诱导CREB磷酸化。结果肺结核组25例中有18例缺失低迁移率条带，说明其缺少与Y-干扰素基因近端启动子结合的蛋白，竞争性EMSA试验结果证实该蛋白复合体中含CREB，对照组中10例有204bp的PCR产物，肺结核组中有12例缺失该产物，提示其缺少与Y-干扰素基因近端启动子结合的CREB；肺结核组中20例未见CREB表达，且所有病例CD3＋T细胞在MTB抗原刺激时不能诱导磷酸化CREB蛋白的产生。结论CREB蛋白可与Y-干扰素基因近端启动子区结合，肺结核患者缺少与Y-干扰素基因近端启动子结合的CREB蛋白。

慢性乙型肝炎患者干扰素水平及其诱生反应

应用微量细胞病变抑制法对9例HBsAg阳性的慢性乙型肝炎（乙肝）患者进行血清干扰素（IFN）活性和外周血白细胞IFN诱生活力的测定。以19名健康献血员作对照。在首次给患者注射国产聚肌胞（PolyI：C）前、注射后6h、24h的再测定其血清IFN和外周血白细胞IFN诱生活力。其次，对患者血清中有无IFN的抑制物质及抗IFN拮抗物质的问题亦进行了研究，

检测人Ⅰ型干扰素生物学活性的新方法

为建立一种更简便、安全、有效的检测Ⅰ型干扰素 (IFN)的方法 ,将可被Ⅰ型IFN诱导的人 6 - 16基因启动子与表达产物容易被检测的 β -半乳糖苷酶基因相连 ,构建成重组质粒 ,然后转染人羊膜传代细胞系 ,筛选阳性克隆 ,最终建立了一种适用于检测Ⅰ型IFN的简便、快速、敏感、特异和重复性好的新型方法 ,其敏感性同标准的细胞病变抑制法相同。

治疗乙肝 选择干扰素好还是拉米呋啶好

干扰素和拉米呋啶都是治疗乙肝的有效药物。然而它们有什么区别,患者该如何选择呢?请听专家评说。

新城疫病毒逃逸干扰素反应促进自身增殖的研究进展

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Diseasevirus,NDV)所引起的禽类传染病,具有高致病性、高接触性和高致死性等特点。NDV感染宿主初期,机体细胞感受到外界的刺激后会作出一系列天然免疫反应以此来抵抗病毒的进一步感染。干扰素(IFN)作为细胞抗病毒因子,在抗病毒感染的先天性免疫应答中起关键作用。作为对病毒刺激的反应,细胞产生和释放IFN,然后作用于邻近的细胞,诱导数百个基因的转录,这些基因产物或直接对抗病毒感染,或参与随后的一系列免疫反应。然而NDV也进化出了多种应对宿主IFN反应的反应机制。深入了解NDV抑制IFN反应的机制,有助于进一步理解NDV的感染及复制过程,为更有效的防控措施提供思路。综上,本文将详细地介绍NDV逃避宿主IFN反应的机制研究进展,旨在为后续相关研究提供参考。

Elispot检测抗原特异性IFN-γ反应在肺外结核诊断中的应用价值

目的评价酶联免疫斑点(Elispot)检测外周血中结核分枝杆菌性抗原特异性γ干扰素(IFN-γ)水平在肺外结核诊断中的价值。方法利用Elispot技术分别对24例肺外结核患者(肺外结核组)和97健康对照(对照组)外周血中产生结核菌抗原特异性IFN-γ的水平进行定量检测。对其中20例肺外结核病人和20例健康者同时采用澳大利亚CELLESTIS公司生产的全血干扰素试剂(QFT-G)进行IFN-γ分泌水平的平行检测。结果肺外结核组中IFN-γ水平和应答的阳性率显著高于对照组(P<0.05);Elispot、QFT-G检测肺外结核组和健康者的反应阳性率分别是:76.1%、84.2%,健康者中分别为10%、20%;两种方法检测结果没有统计学差异(χ2=1.1250,P>0.05)。结论Elispot试剂的检测结果与QFT-G基本一致,可用于肺外结核的辅助诊断。

黄颡鱼FTR67基因的克隆及功能研究

鱼类TRIM(Tripartite motif)家族的特异性扩张产生了一个硬骨鱼类特有的亚家族finTRIM(Fish novel TRIM,FTR),为探究finTRIM在黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)先天抗病毒免疫中发挥的作用,文章鉴定了1个与斑马鱼(Danio rerio)FTR67同源性较高的黄颡鱼finTRIM基因,命名为TfFTR67(Tachysurus fulvidraco FTR67)。系统进化树分析表明,FTR67在有些鱼类物种中发生了基因重复,导致基因拷贝增多。TfFTR67不受SVCV的诱导表达,是一个组成型表达的基因。过量表达TfFTR67抑制poly(I﹕C)及RLR信号分子诱导的干扰素反应,同时促进病毒在细胞中的复制。鉴于TfFTR67与斑马鱼FTR67的表达特征和功能不同,研究结果表明,鱼类FTR67在不同物种中发生了基因重复和功能歧化。

γ-干扰素释放反应与PPD皮试在肾结核诊断应用比较

目的:采用结核分枝杆菌特异性IFN-γ免疫酶联斑点法(Elispot)与传统的结核菌素(PPD)皮试对肾结核患者及健康人群结核分枝杆菌感染现状进行检查,并比较两种方法的差异。方法:采用自主研制的Elispot试剂盒和PPD皮试,对14例肾结核患者及133例健康志愿者进行平行检测。结果:14例肾结核患者检测中,13例PPD阳性,12例Elispot阳性.差异无统计学意义。133例志愿者中86例PPD阳性,22例Elispot阳性.差异有统计学意义。结论:Elispot试剂盒在健康人群中检测阳性率远低于PPD皮试,而在肾结核的检测中差异无统计学意义。Elispot在区分肾结核患者与健康人方面价值优于PPD皮试。在肾结核的诊断有较好的发展前景。

干扰素刺激反应元件Ⅰ/Ⅱ在维甲酸诱导基因G表达调控中的作用

目的 深入研究维甲酸诱导基因G（retinoic acid-induced gene G,RIG-G）启动子上所含的干扰素刺激反应元件（interferon-stimulated response elements,ISRE）对RIG-G基因表达的调控作用.方法 根据RIG-G基因启动子所包含的ISRE序列,利用定点突变技术分别构建野生型和位点突变型的报告基因质粒,然后采用报告基因转染实验检测RIG-G基因启动子中ISRE序列的功能活性.结果 研究发现单独突变RIG-G基因启动子上的ISRE Ⅱ元件不影响报告基因的表达,而单独突变ISRE Ⅰ则会对报告基因的表达产生明显的抑制作用;同时突变ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件则会使报告基因完全失去对转录因子的反应性.结论 RIG-G基因启动子所包含的ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件是诱导该基因表达的转录因子复合物的作用位点,是该基因表达的分子基础,且ISRE Ⅰ元件的作用要优先于ISRE Ⅱ.

干扰素诱导RIG-G基因表达调控机制研究

目的探讨α干扰素（interferon α,IFNα）调控维甲酸诱导基因（retinoic acid-inducedgene G,RIG-G）表达的分子机制。方法应用http：//www.gene-regulation.com网站提供的AliBaba2.1软件对RIG-G基因的启动子区域进行分析,并采用荧光素酶报告基因转染实验和凝胶电泳迁移实验检测RIG-G基因启动子的功能活性及其对IFNα的反应性。结果发现在RIG-G基因的启动子序列中包含2个保守的干扰素刺激反应元件（IFN-stimulated response elements,ISREs）。转录因子STAT1蛋白（signal transducer and activator of tran-scription1）能够与这两个反应元件ISREⅠ和ISREⅡ相互结合。此外,在HT1080细胞中,与空载pXP2报告基因相比,含有ISREⅠ和ISREⅡ的pXP2-A报告基因表现出很强的基础活性（1741.2±517.5）,且这种活性还可被IFNα增强3～4倍（5338.7±1226.9,P〈0.05）。而在STAT1缺陷的U3A细胞中,pXP2-A报告基因的活性则被明显消弱（从1741.2±517.5降到406.1±103.2,P〈0.05）,加入IFNα也不能使其加强,表明STAT1蛋白是ISREⅠ和ISREⅡ发挥活性所必需的。结论RIG-G基因启动子所包含的ISREs是IFNα诱导RIG-G基因表达的分子基础,RIG-G是一个受STAT1蛋白直接调控的靶基因,在IFNα的信号转导途径中发挥着重要的作用。

外周血IFN-γ的检测在结核分枝杆菌潜伏感染诊断中的价值

目的探讨利用酶联免疫斑点(Elispot)法检测外周血结核抗原特异性γ干扰素(IFN-γ)应答反应在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值。方法将150例健康者按结核暴露程度分成4级,采用Elispot技术检测其外周血单个核细胞(PBMC)结核菌抗原特异性IFN-γ分泌水平;其中111例进行结核菌素皮试(PPD皮试);39例采用全血干扰素试剂(Quantiferon-TB-Gold,QFT-G)进行IFN-γ分泌水平的平行检测。结果采用Elispot检测结果显示体外IFN-γ应答反应水平与结核菌暴露程度成正相关(r=0.4155,P<0.0001),不同暴露程度分级的IFN-γ应答阳性率分别是:4级(55.6%)、3级(33.3%)、2级(16.7%)、1级(6.8%)。不同暴露程度分级与PPD皮试结果的相关性没有统计学意义(r=0.1206,P=0.2073);不同暴露程度分级的PPD皮试反应阳性率分别为4级(33.3%)、3级(27.8%)、2级(11.1%)、1级(22.0%)。对Elispot检测结果与QTF-G检测结果进行平行比较分析,两种方法检测结果没有统计学差异(χ2=0.125,P=0.7237)。结论外周血结核抗原特异性γ干扰素(IFN-γ)应答反应水平与结核菌暴露程度成正相关,Elispot检测体外IFN-γ应答反应在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值优于PPD皮试,可以用于对潜伏感染者的筛查。

卡介苗对结核分枝杆菌IFN-γ酶联免疫斑点检测法的影响

目的探讨卡介苗(BCG)对结核分枝杆菌IFN-γ酶联免疫斑点(简称Elispot)检测影响,评价Elispot检测在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值。方法对98例某高校学生同时进行Elispot检测和PPD皮试,其中27例PPD皮试结果和Elis-pot检测均为阴性的受试者进行卡介苗接种。结果 98例受试者中,48例PPD皮试阳性,13例Elispot检测阳性,两种检测结果比较差异有统计学意义。对上述27例受试者接种BCG后PPD皮试结果全转为阳性,Elispot检测仍为阴性。在BCG接种前后,ESAT-6和PoolA作用下IFN-γ分泌水平均无差异;但在BCG作用下,BCG接种后IFN-γ分泌水平显著高于接种前。结论 Elis-pot检测体外IFN-γ应答反应不受卡介苗接种影响,在诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值优于PPD皮试。

HBsAg抑制聚乙二醇化α干扰素治疗敏感性的初步分子机制

目的:对HBsAg引起干扰素治疗无效的机制进行初步探讨,为乙肝患者的治疗提供新思路。方法:分别以HBIG和RNAi技术调节HepG2.2.155细胞内HBsAg含量,再用Western blot、qRT-PCR和ELISA等方法检测PP2Ac、PRMT1蛋白及mRNA水平;分析干扰素对HBsAg诱导的PP2Ac表达有无影响。结果:用HBIG可以增加细胞内HBsAg含量,当HBsAg增加时PP2Ac的水平也会提高;当存在干扰素时,并不会影响HBsAg对PP2Ac的作用,而且PP2Ac的下游蛋白PRMT1表达会降低;用RNAi技术下调HBsAg的表达时,PP2Ac的蛋白和mRNA的水平也会下降。结论:HBsAg可以上调PP2Ac的表达,从而抑制了PRMT1的活性,影响干扰素治疗的敏感性。HBsAg可以影响Peg-IFNα的敏感性,可能是提高慢性乙型肝炎患者疗效的一个潜在靶标。

比较结脑病人血液和脑脊液IFN-γ的表达水平

目的采用结核分枝杆菌特异性IFN-γ酶联免疫斑点(Elispot)检测结核性脑膜炎病人外周血和脑脊液细胞中IFN-γ的表达,评价该方法在结核性脑膜炎诊断中的应用情况。方法采用自建立的结核分枝杆菌特异性IFN-γElispot检测技术(简称Elispot)检测16例结核性脑膜炎病人PBMC和脑脊液中结核菌特异性IFN-γ水平。结果 ELISPOT检测两种细胞分别在ESAT6蛋白和Pool A多肽的作用下,释放的IFN-γ水平均没差别(P>0.05);两种标本ELISPOT检测阳性率没有差异(P>0.05)。结论建立的结核特异性的Elispot检测诊断方法适用于脑脊液标本的检测,并且其检测效果与外周血细胞的检测是基本一致。

体外γ-干扰素检测结核分枝杆菌不同方法的应用价值比较

目的探讨结核分枝杆菌相关γ-干扰素体外释放(TB-IGRA)定量试验,对于结核病诊断的应用价值。方法用国产TB-IGRA试剂定量检测342例结核病患者、143例非结核病患者外周血特异性γ-干扰素的含量,同时与澳大利亚QFT GIT和英国牛津T-SPOT.TB试剂进行平行比较分析。结果 TB-IGRA试剂对结核病患者的检测阳性率为90.1%,且对肺结核与肺外结核的检测差异无统计学意义,检测结果不受BCG的影响,与QFT GIT和T-SPOT.TB试剂比较,3种方法差异无统计学意义。结论 TB-IGRA检测结核分枝杆菌有较高的敏感性,对于结核病的诊断及预防有较好的应用价值。