聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体Ⅱ

目的:用聚乙二醇(PEG)修饰集成干扰素突变体Ⅱ(IFN-Con-m2,IIFNm2),通过纯化获得新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋白酶水解稳定性及初步药代动力学研究。方法:将mPEG20000定点偶联到IIFNm2的第86位Cys残基上,修饰后的产物经CM层析后,以SDS-PAGE考察其纯度,用WISH-VSV系统进行生物活性测定;在0.1%胰蛋白酶条件下考察体外抗酶解稳定性;并以SD大鼠进行初步药代动力学研究,绘制血药浓度-时间曲线。采用3P87软件进行数据拟合,分析药物动力学参数。结果:干扰素修饰率约为50%,且绝大多数以单修饰体(mono-PEG-IIFNm2)形式存在;提纯后mono-PEG-IIFNm2的纯度大于98%,比活性约为修饰前IIFNm2的1%。抗胰蛋白酶水解试验表明:30min后,IIFNm2抗病毒活性残留为8%,mono-PEG-IIFNm2为41%。初步药代动力学研究显示:IIFNm的消除半衰期为(1.57±0.34)h,mono-PEG-IIFNm2为(18.0±4.0)h。结论:成功地偶联了PEG和IIFNm2,建立了mono-PEG-IIFNm2的纯化工艺,PEG修饰能增加IIFNm2的体外抗胰蛋白酶水解稳定性,并显著延长体内半衰期。

集成干扰素突变体Ⅱ的分子构建、表达及提纯

目的:通过定点突变,构建集成干扰素突变体Ⅱ(IFN-Con-m2),以期获得兼具高效作用和可定点聚乙二醇(PEG)修饰的新型药物分子。方法:采用PCR体外定点突变技术,使集成干扰素突变体Ⅰ(IFN-Con-m1)基因的第86位密码子由TAC突变为TGC。将扩增片段克隆入pET-23b表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导后,表达的IFN-Con-m2经包涵体变复性、疏水层析、DEAE层析和凝胶过滤层析等纯化后,用WISH-VSV系统进行生物活性测定。结果:IFN-Con-m2以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,IFN-Con-m2的纯度大于95%,比活性大于5.0×108IU/mg。结论:构建了IFN-Con-m2的表达载体,并成功地在大肠杆菌中表达,获得了高活性突变分子IFN-Con-m2,建立了IFN-Con-m2的纯化工艺。

复合干扰素突变体在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素突变体基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,将重组载体pMEX CIFNm用SacⅠ线性化后 ,转化毕赤酵母GS115 .转化子经诱导后 ,培养上清有抗病毒活性的蛋白产生 .经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤三步层析纯化 ,得到了纯度大于95 %的重组复合干扰素突变体 ,经N端氨基酸序列分析表明 ,该蛋白N端序列与理论值一致 ,质谱测定分子量为 19 3kD ,与理论值一致 .用细胞病变抑制法测定其活性 ,并结合Lowry法蛋白定量计算其比活性为 6× 10 8IU mg ,与复合干扰素的比活相当 .

人α1型干扰素突变体(IFN-α1/86D)的组建及其生物学活性的研究

本文采用核苷酸指导下的定位突变方法,以Asp置换了人α型干扰素86位的Cys,构建成突变体IFN-αI(86D)。后者在大肠杆菌中的表达水平比其母株(IFN-αI/86C)提高了2.8倍,IFN-αI(86D)在4℃的稳定性也较母株为高。

人γ干扰素突变体(hIFNγ135-X14)在大肠杆菌中高效表达

利用体外重组技术，将人γ干扰素／β肿瘤坏死因子融合蛋白（ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１３－ｈＴＮＦβ１４８，ｈγＴＮＦβ）的基因５′端ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１３编码序列取出，添上终止密码子，克隆到ｐＢＶ２２０表达载体ＰＲＰＬ串联起动子的下游，构建成人γ干扰素突变体（ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１４）表达质粒．在质粒构建过程中，原载体上紧接ＳＤ序列后的ＥｃｏＲ１位点被新引入的Ｘｂａ１位点所取代，重组后的质粒，ＳＤ序列与ＡＴＧ起始密码子之间的核苷酸数达到１０个．经转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α，温敏诱导表达，细菌稳定高效地表达了人γ干扰素突变体（１８ｋＤ），表达量约占菌体总蛋白的４２％，表达产物主要以包涵体形式存在．经初步纯化复性后，表达产物的干扰素（ＩＦＮ）抗病毒比活性达到１．１８×１０６Ｕ／ｍｇ蛋白．

人αⅠ型干扰素突变体(HuIFN-α1/86D)具有较高的生物学活性和热稳定性

人α型干扰素基因可以分为两大类:IFN—αI和IFN—αII.在IFN—αI中至少有15种在结构和功能上略有差别的成员,它们的氨基酸序列有80—95%的同源性,在166个氨基酸中大约有一半是高度保守的.其中1和99位Cys,29和139位Cys之间形成二硫键,后者对维持干扰素分子的活性是十分重要的.但是,人IFN—αI在86位有第5个Cys,

重组人血清白蛋白突变体干扰素2b融合蛋白的纯化

在成功构建人血清白蛋白突变体干扰素α2b融合蛋白(rmHSA-IFN-α2b)毕赤酵母工程菌株PicZαA/rmHSA-IFN-α2b/X33的基础上,建立了发酵分泌表达rmHSA-IFN-α2b的纯化工艺。对工程菌进行9 L罐高密度发酵后,离心收集发酵液上清,rmHSA-IFN-α2b的表达量为421 mg/L。对发酵液上清,依次进行3步纯化。第一步采用SP sepharose FF除去大部分色素和部分杂蛋白。第二步采用Blue sepharose FF根据亲和作用原理除去部分杂质。第三步采用Q sepharose FF除去溶剂和其他杂质以及类毒素。最终得到高纯度、有活性的rmHSA-IFN-α2b。通过HPLC检测和SDS-PAGE检测,最终产品的纯度都大于95%;通过活性检测,rmHSA-IFN-α2b的比活为1.5×106IU/mg。纯化总收率为25.3%。连续重复纯化6批,结果稳定。该工艺简单稳定,容易放大,适合规模化生产。简单高效纯化工艺的建立,为rmHSA-IFN-α2b后续研究奠定了坚实的基础。