小鼠抗内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)多克隆抗体的制备

目的以纯化的内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)免疫小鼠制备其多克隆抗体并鉴定其特异性。方法对BALB/c小鼠颅内注射鸭坦布苏病毒,刺激小鼠脑组织产生viperin,通过反转录PCR从小鼠大脑组织克隆viperin,并将其插入至pGEX-6P-1原核表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta。用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对重组蛋白诱导表达,对其进行可溶性分析,以氯化钾染色切胶法对大量表达蛋白进行纯化;将纯化的重组viperin蛋白经腹部皮下免疫小鼠制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定多抗效价,Western blot法和间接免疫荧光法(IFA)检测BHK-21仓鼠肾成纤维细胞瞬时表达的viperin蛋白鉴定viperin抗体的特异性和敏感性。结果成功克隆并表达小鼠viperin基因,制备的抗体效价可达1∶25600,小鼠抗viperin多克隆抗体可特异性识别BHK-21细胞表达的viperin蛋白。结论成功制备特异性较好的小鼠抗viperin多克隆抗体。

干扰素诱导跨膜蛋白抑制小儿流感病毒作用及其机制研究

目的探讨干扰素诱导跨膜蛋白抑制小儿流感病毒的作用及其机制。方法采用实时荧光定量技术对基因表达进行定量分析,先把基因表达进行归一化,然后对实时荧光定量技术的检测条件进行调整,分析蛋白基因扩增的稳定性、灵敏性以及特异性,建立一个体系方法对内参基因、目的基因在细胞中的表达水平进行准确的测定,分析流感病毒NS蛋白和IFITM1\2\3表达水平之间的关系,并对IFITM1\2\3的蛋白表达量进行定量检测。结果 A549细胞株经过干扰素的诱导后,IFITM1、IFITM2、IFITM3的DNA拷贝数都明显增加。结论 IFITM1、IFITM2、IFITM3对于流感病毒NS蛋白具有抑制的作用。

干扰素诱导性跨膜蛋白抑制HIV细胞间传播

正常人体细胞能够表达一类干扰素诱导性跨膜蛋白（Interferon induced transmembranes, IFITMs）.该蛋白具有抗病毒的活性,且已被证实对甲型流感病毒、西尼罗病毒、登革热病毒和埃博拉病毒等多种病原体具有抑制作用.近期,研究人员发现IFITM蛋白可以抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）的传播与发展.

干扰素诱导跨膜蛋白基因多态性与HBV感染程度的关联

目的探究干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)基因多态性与乙型肝炎病毒(HBV)感染程度的关系.方法选择2017年1月-2021年1月武汉市新洲区人民医院收治的104例HBV感染患者为研究组,按照HBV感染损伤肝功能的程度将患者分为A组(Child-Pugh A级,n=31)、B组(Child-Pugh B级,n=30)和C组(Child-Pugh C级,n=43),选择同一时间段内于医院进行体检的90名健康体检者为对照组;采用直接测序法检测IFITM基因多态性,并采用Logistic回归分析IFITM3基因多态性与HBV感染程度的关联.结果研究组IFITM3基因rs12252位点CC基因型、C等位基因频率高于对照组(P<0.05);不同HBV感染程度患者IFITM3基因rs12252位点CC基因型、C等位基因频率比较,差异有统计学意义(P<0.05);Logistic回归分析结果显示,IF-ITM3基因rs12252位点加性模式中携带CC基因型者HBV重度感染风险是携带TT基因型者的3.600倍(P<0.05),rs12252位点隐性模式中携带CC基因型者HBV重度感染风险是携带TT+TC基因型者的3.527倍(P<0.05);IFITM3基因rs12252位点CC基因型是HBV感染程度的危险因素(P<0.05).结论IFITM3基因rs12252位点多态性与HBV感染程度相关,CC基因型可能增加重度HBV感染风险.

隔药饼灸调节大鼠免疫抑制机制的转录组测序分析

背景:免疫抑制会导致机体免疫功能受损,加重病情。隔药饼灸能有效调节机体免疫功能,提高机体免疫力,但其调节机制目前仍不清楚。目的:基于转录组学的生物信息学技术对隔药饼灸干预的免疫抑制模型大鼠进行测序,探究隔药饼灸调控免疫的机制。方法:将24只SD大鼠随机分为空白组、模型组和隔药饼灸组,每组8只,模型组与隔药饼灸组采用腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制模型,35 mg/kg,连续3 d,造模结束后空白组与模型组不做干预,隔药饼灸组在大鼠中脘、神阙、关元及足三里穴位进行艾炷与药饼结合的隔药饼灸干预,连续10 d,1次/d,干预结束后次日取材。取各组大鼠外周血进行白细胞数量检测;采用Illumina测序平台进行RNA-seq,筛选差异基因,结合GO与KEGG数据库,对差异基因进行生物信息学相关分析。结果与结论:①与空白组比较,模型组白细胞数量显著减少(P<0.001)。②RNA-seq共筛选出模型组与空白组间差异基因3026个,其中1565个上调、1461个下调,隔药饼灸组与模型组间差异基因535个,其中280个上调、255个下调。③韦恩图分析获得模型组与空白组159个下调基因经隔药饼灸干预后上调,蛋白互作网络分析获得Oasl,Oas2,Isg15,Herc6,Mx2,Helz2,Mx1,Syk,Hspa1a及Ret等10个核心靶点;④GO与KEGG分析隔药饼灸调节机体的机制有免疫应答途径、病毒相关、血管新生和自身免疫系统等通路。⑤上述结果证实,实验筛选出隔药饼灸干预免疫抑制与Oasl,Oas2,Isg15,Herc6,Mx2,Helz2及Mx1靶点有明显关联,并且在免疫应答、病毒相关及血管新生等通路中发挥调控作用。

稳定表达人IFITM3的A549细胞株建立及其对禽流感病毒感染的抑制作用

目的:为深入研究IFITM3抗禽流感病毒作用及其分子机制提供细胞模型,建立稳定表达人IFITM3蛋白的A549细胞株。方法:首先合成引物,分离人外周血单个核细胞,PCR扩增IFITM3基因,进行DNA测序分析。测序正确后,将其克隆至慢病毒表达载体p LV-Puro中构建真核表达质粒p LV-IFITM3,转染A549细胞,在确定IFITM3可表达后,利用嘌呤霉素加压筛选稳定表达IFITM3的细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot方法对获得的稳定细胞株进行鉴定,同时分析IFITM3蛋白在稳定细胞株的分布及其对细胞活性的影响。最后,基于建立的稳定细胞株,用H5N1亚型禽流感病毒作为病毒测试模型,对IFITM3的抗病毒活性进行了初步评价。结果:成功获得人外周血单个核细胞源IFITM3基因,构建了重组慢病毒表达质粒,并通过质粒转染结合嘌呤霉素压力筛选获得稳定表达IFITM3的A549细胞,且IFITM3主要分布在膜组分上,并对细胞活性无显著影响,同时IFITM3可抑制H5N1亚型禽流感病毒感染。结论:成功获得稳定表达IFITM3的A549细胞,证明了IFITM3可抑制H5N1亚型禽流感病毒感染,为进一步深入探讨IFITM3限制流感病毒感染的作用机制和分子机理提供了细胞模型和实验基础。

干扰素的诱生及作用机理

干扰素是由病毒感染细胞,或其它诱导剂诱导细胞而生成的。干扰素释放后与周围细胞发生反应,诱导其形成二次蛋白(翻译抑制蛋白)而产生抗病毒作用。γ-干扰素除有抗病毒、抗肿瘤作用外,并在免疫系统起调节作用,它还对各类型细胞发挥一系列抗细胞作用。

基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3^+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3^+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.

猪Viperin的C末端结构域促进PEDV RNA合成

为了研究猪干扰素诱导内质网关联病毒抑制蛋白(Viperin)基因各个功能区对猪流行性腹泻病毒(PEDV)RNA合成的影响,本试验构建了猪源Viperin各个功能区的质粒,将质粒在Vero E6细胞中过表达。免疫荧光和蛋白印迹试验结果显示,猪Viperin各个功能区均在Vero E6细胞质中正确表达;用PEDV感染过表达Viperin的Vero E6细胞,荧光定量PCR检测结果显示,Viperin能够显著提高病毒RNA水平;用PEDV感染的siRNA干扰Vero E6细胞,荧光定量PCR检测结果显示,干扰Viperin基因表达可显著抑制病毒RNA水平;用PEDV感染过表达Viperin各个功能区的Vero E6细胞,荧光定量PCR检测结果显示,Viperin的C末端区域能够显著促进病毒RNA合成。因此,本试验为最终阐明宿主体内Viperin调控病毒增殖的机制提供了一定的试验依据。

HIV感染合并肺部感染患者 CD3+CD4+-T细胞表达的研究

目的探讨α干扰素(Interferon-α,IFN-α)、干扰素诱导基因56(Interferon-stimulated gene 56,ISG56)、粘病毒抵抗蛋白A(Myxovirus resistance protein A,MxA)、免疫调控受体程序性死亡分子1(Programmed death-1,PD-1)和T细胞免疫球蛋白及免疫酪氨酸样抑制基序(T cell immunoglobulin and ITIM domain,TIGIT)对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)合并肺部感染患者CD3^+CD4^+-T细胞表达的影响。方法选取2016年12月-2017年12月于余姚市市人民医院就诊的52例HIV合并肺部感染患者作为研究组进行研究,另选择同期48例HIV未合并肺部感染患者作为对照组,检测患者外周血CD3^+CD4^+-T细胞表面的IFN-α、ISG56、MxA、PD-1和TIGIT指标水平情况。结果研究组CD3^+CD4^+-T细胞比例高于对照组(P<0.05);研究组IFN-α、ISG56、MxA分别为(15.82±5.31)、(0.74±0.22)、(0.83±0.14)pg/ml低于对照组(P<0.001);研究组TIGIT和PD-1的CD3^+CD4^+-T细胞分别为(23.61±12.83)%、(51.32±13.74)%高于对照组(P<0.05);研究组TIGIT CD3^+CD4^+-T细胞表面百分数与CD4+-T细胞绝对数呈负相关(P=0.027);与病毒载量呈正相关(P=0.001);研究组PD-1CD3^+CD4^+-T细胞表面百分数与CD4+-T细胞绝对数呈负相关(P=0.026);与病毒载量无相关性(P=0.711)。结论HIV合并肺部感染患者,CD3^+CD4^+-T细胞占比上升,IFN-α、ISG56、MxA降低,TIGIT和PD-1升高,相关指标变化证明当受到感染时机体免疫功能会发生紊乱,且与HIV疾病进展具有一定程度的相关性,具有一定的临床价值。