猪干扰素诱导跨膜蛋白3的克隆表达及多克隆抗体制备

为原核表达猪干扰素诱导跨膜蛋白3(swine interferon-induced transmembrane protein 3,SwIFITM3)并制备其多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb),从干扰素刺激的猪外周血淋巴细胞中克隆到SwIFITM3编码基因,然后采用大肠埃希氏菌表达系统表达并纯化目的蛋白免疫小鼠制备其pAb;并以制备的pAb为一抗用Western blot检测了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)中SwIFITM3表达情况。结果显示,获得了438 bp的SwIFITM3基因,将获得的目的基因插入pColdⅠ载体构建重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导24 h后获得了大小约19 ku可溶性表达的目的蛋白,以Anti-His单克隆抗体为一抗进行Western blot检测,获得了与预期大小一致的印迹条带;用纯化的目的蛋白腹腔注射免疫小鼠3次,采用间接ELISA方法检测,小鼠血清中SwIFITM3抗体效价最高达1∶1024000;以制备的pAb为一抗的Western blot检测显示PRRSV感染导致PAMs中SwIFITM3蛋白表达显著降低。试验结果为猪IFITM3的生物学功能及相关研究积累了材料。

脓毒症并发急性肾损伤患者外周血单个核细胞中微小RNA-16-5p、干扰素诱导跨膜蛋白3表达及临床意义

目的检测脓毒症及脓毒症并发急性肾损伤(sepsis-associated acute kidney injury,S-AKI)患者外周血单个核细胞中微小RNA-16-5p(microRNA-16-5p,miR-16-5p)、干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein,IFITM3)表达情况,分析两者对S-AKI患者的临床意义。方法本研究以2019年2月至2021年2月武汉市蔡甸区人民医院确诊的脓毒症患者为研究对象,共纳入106例,将合并急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的脓毒症患者作为AKI组(52例),未合并AKI的患者为非AKI组(54例)。收集所有患者的血液样本3 mL并分离单核细胞,利用实时荧光定量技术检测外周血单个核细胞中miR-16-5p、IFITM3 mRNA的表达水平,酶联免疫吸附法测定外周血中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)水平,全自动生化分析仪检测外周血中胱抑素(cysteine,Cys)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平;比较两组间的临床指标及miR-16-5p、IFITM3 mRNA表达水平,Pearson法分析miR-16-5p、IFITM3 mRNA分别与BUN、Cys水平的相关性,以及miR-16-5p与IFITM3 mRNA表达水平的相关性,采用多元线性回归分析S-AKI患者miR-16-5p、IFITM3 mRNA表达水平的影响因素,受试者工作特性曲线(receiver operator characteristic curves,ROC)评估miR-16-5p和IFITM3 mRNA对脓毒症患者发生S-AKI的诊断价值。结果AKI组患者急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluationⅡ,APACHEⅡ)评分(15.67±4.39比13.31±3.56)、序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment,SOFA)评分(5.62±1.28比4.89±1.41)、IL-1β[(22.03±5.78)mg/L比(10.44±3.05)mg/L]、Cys[(2.72±0.45)mg/L比(1.98±0.31)mg/L]和BUN[(7.93±2.24)μmol/L比(4.49±2.07)μmol/L]水平均高于非AKI组患者(P<0.05),AKI组患者的miR-16-5p(1.64±0.30比1.17±0.28)表达水平显著上调,IFITM3 mRNA(2.87±0.62比4.06±0.92)及蛋白(1.63±0.41比3.15±0.85)(r=0.560,P<0.05)水平呈正相关,IFITM3 mRNA表达水平与IL-1β(r=-0.754,P<0.05)、Cys(r=-0.554,P<0.05)、BUN(r=-0.695,P<0.05)水平呈负相关,miR-16-5p与IFITM3 mRNA的表达水平呈负相关(r=-0.496,P<0.05);多元线性回归分析结果显示,IL-1β升高、Cys升高是miR-16-5p、IFITM3 mRNA表达水平的影响因素(P<0.05);miR-16-5p、IFITM3 mRNA单一检测诊断脓毒症患者发生S-AKI的曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.876(95%CI:0.809~0.944)、0.874(95%CI:0.811~0.938),miR-16-5p和IFITM3 mRNA联合检测的AUC为0.956(95%CI:0.929~0.992)。结论S-AKI患者中miR-16-5p表达上调,IFITM3表达下调,与S-AKI的病理过程密切相关,可能通过促进炎症反应加重肾损伤,有助于早期诊断S-AKI,为临床治疗S-AKI提供了有希望的靶点。

干扰素诱导跨膜蛋白3在结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞凋亡的调控作用研究

目的探讨干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM 3)在结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞凋亡的调控作用。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测结肠癌组织和对应的癌旁组织中IFITM 3的表达水平。细胞转染si-IFITM 3抑制IFITM 3的表达,同时转染si-control作为对照,MTT检测转染后48 h的细胞增殖情况。流式细胞术检测细胞凋亡情况。Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3蛋白表达水平。结果 IFITM 3在结肠癌组织中的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。si-IFITM 3组结肠癌细胞HT29和HCT116的存活率与si-control组相比下降,差异有统计学意义(均P<0.05)。转染si-IFITM 3后的结肠癌细胞HT29和HCT116凋亡率高于si-control组,差异有统计学意义(均P<0.05)。转染si-IFITM 3后的结肠癌细胞HT29和HCT116中STAT3蛋白表达水平没有变化,p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平低于si-control组,Bax蛋白表达水平高于si-control组。结论干扰素诱导跨膜蛋白3在结肠癌组织中过度表达。抑制干扰素诱导跨膜蛋白3的表达,可以抑制结肠癌细胞的增殖,促进癌细胞凋亡,其作用机制与Bcl-2、Bax、STAT3有关。

沉默干扰素诱导跨膜蛋白3可抑制肝癌细胞HepG2增殖和侵袭

目的研究干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)在原发性肝癌中的异常表达,探讨沉默IFITM3表达对肝癌细胞系Hep G2生物学特征的影响。方法通过Western blot和免疫组织化学染色法检测60例肝癌组织及对应癌旁组织中IFITM3的表达情况及相关性;构建IFITM3小干扰RNA片段(IFITM3 si-RNA),采用脂质体介导转染肝癌细胞(Hep G2细胞系),同时设置无义序列组和空白对照组,实时荧光定量PCR检测转染后IFITM3 m RNA的表达;CCK8(cell counting kit 8)检测转染后细胞增殖能力;Western blot检测IFITM3在蛋白水平的表达;Transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化。结果和癌旁组织相比,IFITM3在肝癌组织中的明显高表达。与无义序列组和空白对照组比较,IFITM3 si-RNA转染组细胞IFITM3表达和细胞增值率降低,穿膜细胞数也明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。划痕实验也表明迁移能力降低。结论 IFITM3在原发性肝癌中高表达;IFITM3在肝癌细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,有望成为原发性肝癌基因治疗的侯选靶点。

干扰素诱导跨膜蛋白3过表达对胆囊癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭的影响

目的探讨过表达干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)对胆囊癌细胞MHCC97H增殖、迁移、侵袭的影响。方法构建IFITM3-pc DNA3.1过表达载体,并将IFITM3-pc DNA3.1及pc DNA3.1转入MHCC97H细胞中,同时设立正常对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测IFITM3、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(BAX)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)表达,CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果酶切结果证实IFITM3过表达载体构建成功。与正常对照组及过表达对照组比较,过表达组MHCC97H细胞IFITM3 m RNA表达量上调,光密度值(OD)升高,细胞迁移速率加快,细胞侵袭数目增加,Bcl-2 m RNA表达水平上调,BAX m RNA表达水平下调,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。结论过表达IFITM3能显著促进MHCC97H胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭,与调控Bcl-2及BAX表达有关。

干扰素诱导跨膜蛋白3诱导上皮细胞间质转化促进肝癌侵袭转移

目的探讨干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)通过诱导上皮细胞间质转化对肝癌侵袭转移的影响。方法采用Western Blot对比105例肝癌患者癌与癌旁组织的IFITM3表达水平,并结合病理资料分析预后。利用Western blot和q RT-PCR观察肝癌细胞株中IFITM3的表达,选取IFITM3表达较高和较低的细胞株进行沉默和过表达,检测EMT标记物的表达,通过划痕和Transwell实验检测转染后细胞株侵袭和转移能力。结果 IFITM3在肝癌中的高表达。IFITM3的高表达与卫星灶、包膜、血管侵袭和TNM分期相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析发现IFITM3高表达的患者的总体生存率和无病生存率都要更低(P<0.001)。在体外试验中,IFITM3与细胞的侵袭、迁移能力以及上皮细胞间质化水平正相关。结论 IFITM3可以通过诱导上皮细胞间质转化促进肝癌侵袭转移。

干扰素诱导跨膜蛋白3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-9表达与胸中段食管鳞癌改良Ivor-lewis术后淋巴结转移性复发的关系

目的探讨胸中段食管鳞癌(ESCC)干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)和Galectin-9表达及与改良Ivor-lewis术后淋巴结转移性复发的关系。方法改良Ivor-lewis手术治疗的胸中段食管癌病人91例,采用免疫组织化学法(IHC)检测肿瘤组织及癌旁正常组织中IFITM3、Galectin-7、Galectin-9表达情况,并分析其与术后淋巴结转移性复发的关系。结果 ESCC病灶组织中IFITM3、Galectin-7表达量高于癌旁组织,Galectin-9表达量低于癌旁组,差异有统计学意义(P<0.05);ESCC病灶组织中IFITM3、Galectin-7、Galectin-9阳性表达率分别为57.14%、65.93%和60.44%,癌旁组织分别为13.19%、5.49%和89.01%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着TNM分期的升高,IFITM3、Galectin-7的阳性表达率也明显升高(P<0.05)。术后3年内有37例(40.66%)淋巴结复发性转移,TNM分期、IFITM3和Galectin-7过表达、Galectin-9欠表达是淋巴结转移性复发的独立危险因素(P<0.05)。结论 IFITM3、Galectin-7过表达和Galectin-9欠表达参与了胸中段ESCC的发生及发展,且与改良Ivor-lewis术后淋巴结转移性复发密切相关。

干扰素诱导跨膜蛋白3基因多态性与小儿流感易感性及严重性的关系

目的:探讨干扰素诱导跨膜蛋白3基因(IFITM3)多态性与小儿流感易感性及严重性的关系。方法:选取2015年1—11月期间收治确诊的流感患儿60例(普通流感30例和重症流感30例)作为观察组,另选以门诊体检正常儿童60例作为对照组,提取两组患者DNA并扩增相应的目的片段后,采用特异性引物聚合酶链反应技术检测IFITM3 rs12252T/C的单核苷酸多态性,并进行统计学分析。结果:观察组患者中IFITM3基因rs12252 CT基因型明显多于对照组(P<0.05);C、T等位基因频率在观察组和对照组、普通流感、重症流感的分布经比较其差异均无统计学意义(P>0.05);在显性遗传模式中,观察组和对照组中(CC+CT)和TT基因型携带者的分布经比较其差异有统计学意义(P<0.05);在隐性遗传模式中,观察组和对照组中CC和(TT+CT)基因型携带者的分布经比较其差异无统计学意义(P>0.05);在共显性遗传模式分析中,观察组和对照组中CT和(TT+CC)基因型的比例经比较其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:IFITM3基因rs12252 CT基因型可能是儿童流感的遗传易感因子,但C、T等位基因与儿童流感严重性无相关性。

泡球蚴感染对小鼠肝脏TRIF/IRF3通路和IFITM3的影响

目的探索泡球蚴感染后不同时间对小鼠肝脏β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)/干扰素调节因子3(IRF3)通路及干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)的影响。方法对泡型包虫病患者和其他非感染性肝病(肝血管瘤)手术患者的肝脏组织进行HE及免疫组织化学染色,观察肝组织病理变化及IFITM3和叉头框蛋白P3(Foxp3)的表达。48只C57BL/6J雌性小鼠随机分为感染组(腹腔感染泡球蚴后8,30,60,90,180 d)和对照组。Masson染色观察小鼠肝脏纤维化病变,Western blot和实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏TRIF/IRF3通路、IFITM3和Foxp3变化。结果泡型包虫病患者肝脏病灶周围肝组织排列紊乱,有大量炎性细胞浸润;肝血管瘤患者肝脏组织完整。免疫组化检测结果,泡型包虫病患者IFITM3和Foxp3的表达量高于肝血管瘤患者。Masson染色显示泡球蚴感染导致小鼠肝脏纤维化病变。实时荧光定量PCR结果显示,感染组小鼠肝脏TRIF、IRF3、IFNB1和IFITM3 mRNA表达在感染60 d和90 d时均高于对照组(P<0.05),但感染180 d时TRIF、IFNB1和IFITM3 mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);Foxp 3 mRNA的表达随着泡球蚴感染时间呈先上升后下降再上升的趋势,在感染180 d上升到峰值(P<0.05)。Western blot结果显示,泡球蚴感染小鼠90 d,肝脏TRIF、IRF3、IFITM3蛋白表达量均高于对照组(P<0.05),但感染180 d时与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);在感染90 d和180 d时,Foxp3蛋白表达高于对照组,并在180 d上升到峰值(P<0.05)。结论晚期泡球蚴感染时,小鼠肝脏的TRIF/IRF3通路及IFITM3表达下调,影响了天然免疫的抗病原体功能,抑制宿主发挥抗病原体的作用。

干扰素诱导跨膜蛋白1对猪源冠状病毒吸附宿主细胞的影响

为探索干扰素诱导跨膜蛋白1(interferon-inducible transmembrane protein 1,IFITM1)对猪源冠状病毒复制的影响,本研究选用猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)高致病毒株及其宿主细胞PK15作为研究对象。正常PK15细胞接种TGEV后,实时荧光定量PCR检测感染后不同时间点PK15细胞中一些干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的mRNA表达水平;利用慢病毒表达系统构建稳定表达和稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系。将一段靶向干扰猪源IFITM1的shRNA序列及猪源IFITM1全长,分别插入pLKO.1-EGFP-Puro载体及pLVML-Myc-MCS-IRES-Puro载体中,分别构建出pLKO.1-IFITM1shRNA-EGFP-Puro及pLVML-Myc-IFITM1-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞后获得带有目的基因的重组慢病毒,慢病毒侵染PK15细胞后用嘌呤霉素进行筛选,获得稳定表达及稳定干扰IFITM1表达的PK15细胞系,分别命名为PK15-IFITM1及PK15-IFITM1-/-,并分别用实时荧光定量PCR、间接免疫荧光试验(IFA)及Western blotting检测IFITM1干扰效率及表达情况;TGEV接种PK15-IFITM1-/-和PK15-IFITM1,实时荧光定量PCR测定细胞中TGEV的拷贝数。结果显示,PK15细胞接种TGEV后的48 h内,一些ISGs的mRNA水平均有所上升;PK15-IFITM1-/-细胞系的干扰效率为70%,PK15-IFITM1细胞系表达成功;在PK15-IFITM1-/-细胞系中,IFITM1的mRNA水平显著下调,促进了TGEV的复制。反之,在PK15-IFITM1细胞系中,TGEV的复制受到了抑制。但IFITM1的表达或缺失却不影响TGEV对PK15的吸附作用。总之,IFITM1对TGEV有显著的抗病毒作用,IFITM1不影响TGEV对PK15细胞的早期吸附,这为后续IFITM1抗冠状病毒机制的研究奠定了基础。

Ifitm3敲除抑制小鼠神经干细胞增殖和分化

目的建立干扰素诱导跨膜蛋白3基因(Ifitm3)敲除小鼠模型,探究Ifitm3对小鼠神经干细胞增殖和分化的影响。方法利用CRISPR/Cas9技术,建立Ifitm3敲除小鼠模型,通过基因型鉴定和Western Blot检测IFITM3的敲除效果;利用苏木素-伊红(HE)染色和流式细胞术等方法分析Ifitm3敲除小鼠和野生型小鼠的表型差异。分离并培养野生型和Ifitm3敲除小鼠成体神经干细胞,统计神经球数量和大小,qRT-PCR、Western Blot、免疫荧光技术检测神经干细胞增殖和分化的能力。结果成功建立Ifitm3敲除小鼠模型,Ifitm3敲除小鼠发育正常,组织病理学及免疫系统未见明显异常。体外实验显示Ifitm3敲除抑制小鼠神经干细胞的自我更新潜能,导致神经干细胞增殖能力下降,并且抑制神经干细胞向未成熟神经元和星形胶质细胞分化。结论IFITM3缺失导致神经干细胞增殖和分化能力下降,IFITM3可能参与了神经干细胞的功能调节。

包虫囊液干预的肝细胞Foxp3与IFITM3表达变化及其与干扰素刺激蛋白相关性分析

目的观察包虫囊液干预的肝细胞核转录因子Foxp3、干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达变化并分析其与干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。方法从包虫病羊肝脏包囊中抽取囊液,将人肝癌细胞HepG2分为高浓度组、中浓度组、低浓度组及对照组,分别加入1∶10、1∶100和1∶1000浓度比例的囊液及不加囊液,采用Western blotting法及荧光定量PCR法检测各组干预后及低浓度组在干预后0、12、24、36、48、60、72 h细胞中的Foxp3、IFITM3及相关干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白及mRNA表达,采用Spearman分析Foxp3、IFITM3与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。结果不同囊液浓度干预下,IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3、ISG15蛋白及mRNA表达随着干预囊液浓度降低逐渐升高,IFIT3蛋白表达中浓度组>低浓度组、高浓度组(P均<0.05),IFIT3 mRNA高、中、低浓度组差异无统计学意义。低囊液浓度干预下各时点IFITM1、IFITM2、IFIT3蛋白表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、ISG15蛋白表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3蛋白表达随囊液干预时间延长而升高;IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、IFITM1 mRNA表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3 mRNA表达随囊液干预时间延长而升高。Spearman相关分析结果显示,不同囊液浓度干预下Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关(P=0.004);Foxp3 mRNA、IFITM3蛋白及mRNA表达与IFITM1、IFITM2、ISG15 mRNA表达均呈正相关(P均<0.05),与IFIT3 mRNA表达无相关性;Foxp3蛋白表达与IFITM1、ISG15蛋白表达呈正相关(P均<0.05),与IFITM2和IFIT3蛋白表达无相关性。低囊液浓度干预下各时点Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关(P均<0.05);Foxp3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈负相关;IFITM3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈正相关(P均<0.05)。结论在低浓度包虫囊液干预下,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3及ISG15表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关;随着囊液干预时间的延长,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFIT3、ISG15表达降低、Foxp3的表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关。

IFITM3、BTBD7、PEA3在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:分析干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)、结构域蛋白7(BTBD7)、多瘤病毒增强子激活剂3(PEA3)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及相关性研究。方法:选取2021年2月~2022年2月江门市人民医院进行肺癌手术治疗的80例患者为研究对象,在进行手术过程中,切取其肺癌患者癌组织,为本研究组织标本,同时切取相应的癌旁组织,进行数据的比较。使用免疫组化法检测IFITM3、BTBD7、PEA3表达。观察IFITM3、BTBD7、PEA3在非小细胞肺癌中的表达及相关性。结果:与癌旁组织比较,癌组织IFITM3、BTBD7、PEA3阳性表达率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCLC组织IFITM3、BTBD7、PEA3表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、吸烟史、组织学分型比较差异均无统计学意义(P>0.05)。NSCLC组织中于IFITM3、BTBD7、PEA3表达于TNM分期、分化程度、胸膜转移、淋巴结转移,差异均有统计学意义(P<0.05)。NSCLC组织IFITM3、BTBD7之间表达呈正相关(r=0.518,P=0.001);NSCLC组织BTBD7、PEA3表达呈正相关(r=0.604,P=0.001);NSCLC组织IFITM3、PEA3表达呈正相关(r=519,P=0.001)。结论:NSCLC IFITM3、BTBD7、PEA3表达呈上调状态,三者之间具有密切相关性,与其表达的高低变化与TNM分期、分化程度、胸膜转移、淋巴结转移等临床病理症状之间具有相关性,由此表明,IFITM3、BTBD7、PEA3可能参与NSCLC的发展过程。

肝癌组织IFITM3蛋白表达水平及其与肝细胞癌患者手术切除术后肝内肿瘤复发的相关性分析

目的探讨肝细胞癌(HCC)组织干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达水平及其临床意义。方法在我院接受根治性手术切除治疗的43例HCC患者,术中取癌组织和癌旁肝组织,分别采用Western blot法和免疫组化法检测组织IFITM3蛋白表达情况,比较肝内肿瘤复发与未复发患者癌组织IFITM3表达的差异。结果经Western blot法检测肝癌组织IFITM3表达水平为(1.2386±0.1901),显著高于癌旁组织的(0.9496±0.0995,t=8.832,P=0.000);免疫组化法检测显示肝癌组织IFITM3蛋白阳性率为72.1%(31/43),明显高于癌旁组织的14.0%(6/43,x^2=29.647,P=0.000);中分化肝癌组织IFITM3蛋白阳性率为90.9%(10/11),低分化肝癌组织为95.2%(20/21),均明显高于高分化组的9.1%(1/11)(x^2=14.727, P=0.000;x^2=23.748,P=0.000);术后复发组癌组织IFITM3蛋白阳性率为81.0%(17/21),未复发组为22.7%(5/22),两者比较差异具有统计学意义(x^2=14.578,P=0.000)。结论 HCC组织IFITM3蛋白呈高表达,且肝癌分化越差,IFITM3表达也越强,并可能与术后肿瘤复发有关。

基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3^+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3^+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.

IFITM3对小反刍兽疫病毒在山羊子宫内膜上皮细胞中增殖的调控效应

干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在调控病毒感染过程中发挥重要作用,而其在小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染中是否发挥作用尚不明确。本研究旨在探究IFITM3对PPRV感染的影响。通过Western blot技术检测PPRV感染对山羊子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cells,EECs)中IFITM3表达的影响,进一步通过基因过表达及敲降技术探究IFITM3对PPRV复制的影响。结果表明,PPRV感染山羊EECs后,PPRV N蛋白表达水平持续升高,而IFITM3的表达水平较未感染对照组呈先上升后下降趋势。在感染后2 h,IFITM3的表达极显著上调(P<0.001);感染后3~4 h,IFITM3的表达水平最大(P<0.0001);感染后24 h,IFITM3表达水平下降且与对照组差异不显著。抑制IFITM3表达与对照组相比,PPRV感染后0~6 h,细胞内PPRV的N蛋白水平下降,感染6 h时下降尤为明显(P<0.01);感染后12~24 h,细胞内PPRV的N蛋白水平变化不明显。过表达IFITM3与对照组相比,感染后6 h,细胞内PPRV的N蛋白水平极显著上升(P<0.001);感染后12~24 h,细胞内PPRV的N蛋白水平较对照组不显著。以上结果表明,PPRV感染山羊EECs早期,通过上调IFITM3表达水平促进PPRV在宿主细胞的复制水平。

呼吸道合胞病毒肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达变化及其临床意义

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎患儿外周血单个核细胞干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)、干扰素诱导蛋白27(IFI27)表达变化及其临床意义。方法选择RSV肺炎患儿90例(观察组),其中病情程度低危28例、中危30例、高危32例,选择同期腹股沟斜疝患儿40例(对照组),采集所有研究对象外周静脉血,采用荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达,采用ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ,采用肺功能检测仪检测第1秒用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1%pred)、FEV1/用力肺活量(FVC)。采用Pearson相关分析法分析RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC的关系。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达对RSV肺炎的诊断价值。结果观察组外周血单个核细胞IFITM3、IFI27相对表达量及血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均显著高于对照组,FEV1%pred、FEV1/FVC均显著低于对照组(P均<0.01)。随着病情程度加重,RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27相对表达量及血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高,FEV1%pred、FEV1/FVC逐渐降低(P均<0.01)。RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相关关系,与FEV1%pred、FEV1/FVC均呈负相关关系(P均<0.05)。ROC曲线分析显示,外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达单独和联合预测RSV肺炎的曲线下面积(AUC)分别为0.756、0.763、0.837,外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达联合预测RSV肺炎的AUC高于外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达单独(Z分别为2.096、2.115,P均<0.05)。结论RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达显著升高,二者表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相关关系;外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达对RSV肺炎均有一定预测价值,二者联合预测价值更高。

干扰素诱导跨膜蛋白3基因敲除Caco2细胞株的构建及其对水泡性口炎病毒复制的影响

通过CRISPR/Cas9系统,旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒,经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞,然后进行嘌呤霉素加压筛选,利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定,鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞,通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明,在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失,细胞中IFITM3蛋白表达消失,但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞,表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了基于肠道细胞敲除IFITM3基因的Caco2单细胞克隆,验证了IFITM3敲除对细胞抗VSV感染的影响,为进一步深入研究IFITM3与肠道病毒的互作及其功能奠定基础。

干扰素诱导跨膜蛋白IFITM3在黄羽肉鸡消化系统的分布

利用免疫组织化学技术探讨干扰素诱导跨膜蛋白IFITM3在鸡消化器官中的分布,同时运用RT-PCR和荧光定量PCR技术分析进一步分析肉鸡消化系统中各器官IFITM3蛋白的mRNA表达规律。免疫组化表明,IFITM3在鸡消化器官中均有分布,其中十二指肠IFITM3阳性细胞分布最多;RT-PCR和荧光定量PCR的结果与免疫组化的结果一致。本试验初步探明了IFITM3蛋白在黄羽肉鸡消化器官中的分布规律。

包虫囊液对干扰素信号TRIF/IFITM3通路的影响

目的 探索包虫囊液干预人源肝细胞(L02)过程中TRIF/IFITM3通路相关蛋白的变化。方法 从感染细粒棘球蚴病的羊肝中获取囊液,用不同比例囊液浓度(1∶10、1∶100和1∶1000)干预肝细胞并设置阴性对照组(未加囊液干预)。采用囊液浓度(1∶1000)干预肝细胞后分别在0、24、48和72 h收集细胞。实时荧光定量PCR检测TRIF/IFITM3通路相关mRNA的表达,Western blot检测TRIF、IRF3、IFITM3、Foxp3的蛋白表达变化。免疫荧光检测IFITM3、Foxp3的表达和定位。Spearman分析TRIF、IFITM3及Foxp3的相关性。结果 Western blot显示囊液浓度(1∶1000)促进TRIF、IRF3、IFITM3蛋白表达,TRIF的相对表达量分别是(0.45±0.09)、(0.54±0.05)、(1.08±0.24)、(1.75±0.31);IFITM3的相对表达量分别是(1.02±0.41)、(1.00±0.16)、(1.24±0.12)、(1.84±0.20)。囊液浓度(1∶1000)刺激肝细胞0、24、48和72 h后,Western blot显示TRIF、IRF3、IFITM3蛋白表达量逐渐下降,而Foxp3表达量增高。TRIF的相对表达量分别是(1.00±0.31)、(1.08±0.19)、(0.90±0.13)、(0.57±0.05);IFITM3的相对表达量分别是(0.80±0.26)、(0.94±0.09)、(0.82±0.19)、(0.54±0.18)。Foxp3的相对表达量分别是(0.70±0.11)、(0.80±0.02)、(0.83±0.03)、(1.08±0.04)。免疫荧光显示,在泡球蚴感染60 d时,小鼠肝脏IFITM3和Foxp3发生共定位。Spearman分析TRIF与IFITM3存在正相关性(r=0.704,P<0.01),TRIF与Foxp3存在负相关性(r=-0.859,P<0.01),IFITM3与Foxp3存在负相关性(r=-0.686,P<0.01)。结论 较低浓度的包虫囊液刺激TRIF/IFITM3通路相关分子表达,进而激活天然免疫的抗病原体功能;随着囊液干预时间增加TRIF/IFITM3受抑制,而Foxp3高表达,促进包虫在宿主体内慢性寄生。