干扰素调节因子3促结直肠癌细胞增殖与侵袭相关探索

目的·分析结直肠癌中干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)表达水平与临床病理特征及患者预后的关系,观察IRF3过表达对结直肠癌细胞增殖与侵袭能力的影响及其相关蛋白通路。方法·下载癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据,分析IRF3表达水平与恶性肿瘤患者(肾癌、结直肠癌、肝癌、前列腺癌)预后的关系。采用免疫组织化学法检测10例结直肠癌或肾癌患者的癌组织与癌旁正常组织切片中IRF3表达水平的差异。针对IRF3蛋白的C端残基位点进行改造,构建拟磷酸化IRF3-5D(396/398/402/404/405-D)高表达的HEK-293T细胞。分别在细胞培养12、24 h时,采用TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)抑制剂进行处理,并采用蛋白质印迹法检测细胞IRF3、p-IRF3(Ser386)蛋白表达水平。采用RNA测序技术探索IRF3-5D高表达与肿瘤相关蛋白表达水平的相关性。构建野生型IRF3(IRF3-WT)和IRF3-5D过表达的结直肠癌细胞CT26、COLON26,采用细胞计数法、细胞划痕试验和克隆形成试验检测细胞增殖及迁移能力。结果·TCGA数据分析提示癌组织中IRF3蛋白表达水平与患者的不良预后呈正相关。癌症患者病理组织免疫组织化学法显示,结直肠癌、肾癌组织中IRF3的表达水平显著上调,且蛋白表达集中于细胞核内。TBK1抑制剂分别在细胞培养12、24 h时间点作用后,HEK-293T细胞p-IRF3(Ser386)蛋白表达减弱。RNA测序和蛋白质印迹法结果显示,多个与癌症预后不良相关的蛋白[IRF9、细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1-ligand 1,PD-L1)等]表达水平在IRF3-5D高表达的条件下显著上调。结直肠癌细胞中过表达IRF3-5D,可导致癌细胞的增殖、迁移能力显著上调。结论·结直肠癌中IRF3表达水平与患者不良预后呈正相关。IRF3-5D蛋白在结直肠癌细胞内高表达后,促进癌细胞恶性生物学行为。此外,IRF3-5D依赖于TBK1介导的IRF3活化激活通路,并上调多个肿瘤相关蛋白的表达水平。

日本脑炎病毒感染睾丸间质细胞对干扰素调节因子3相关信号通路的影响

旨在探究日本脑炎病毒(JEV)感染睾丸间质细胞后通过激活视黄酸诱导基因Ⅰ型(RIG-Ⅰ)和Toll样受体3(TLR3)等模式识别受体后引发的先天免疫机制。建立JEV感染睾丸间质细胞模型,利用荧光定量PCR和Western blot技术检测不同感染时段细胞的RIG-Ⅰ、TLR3和干扰素调节因子3(IRF3)的转录和蛋白表达、IRF3的磷酸化以及干扰素β(IFN-β)的转录情况。结果显示:JEV感染后细胞中RIG-Ⅰ和IRF3的mRNA和蛋白表达水平均有显著升高(P<0.05),TLR3蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),IRF3磷酸化水平极显著上调(P<0.001),IFN-β转录水平显著升高(P<0.05)。结果表明:JEV感染可激活睾丸间质细胞的RIG-Ⅰ和TLR3受体,进而激活IRF3磷酸化,启动IFN-β的分泌,启动机体的先天性免疫抗病毒免反应。

溃疡性结肠炎患者血清趋化因子配体19、干扰素调节因子4水平及临床意义

目的探讨溃疡性结肠炎(UC)患者血清趋化因子配体19(CCL19)、干扰素调节因子4(IRF4)水平及临床意义。方法选择2020年6月至2022年5月在该院住院治疗的105例UC患者为UC组,另选取83例健康体检者为对照组。根据Mayo评分将UC患者分为缓解期组(n=35)和活动期组(n=70)。根据活动期病情严重程度,将活动期UC患者分为轻度组(n=19)、中度组(n=23)和重度组(n=28)。根据患者预后情况分为预后良好组和预后不良组。采用酶联免疫吸附试验检测血清CCL19、IRF4水平;采用Pearson相关分析血清CCL19、IRF4水平与Mayo评分的相关性;采用多因素Logistic回归分析影响UC患者预后的因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清CCL19、IRF4水平对UC患者预后不良的预测价值。结果UC组血清CCL19、IRF4水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。缓解期组血清CCL19、IRF4水平低于活动期组,差异均有统计学意义(P<0.05)。重度组血清CCL19、IRF4水平明显高于轻度组和中度组,且中度组明显高于轻度组,差异均有统计学意义(P<0.05)。预后良好组CCL19、IRF4、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)水平明显低于预后不良组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析结果显示,UC患者血清CCL19、IRF4水平均与Mayo评分呈正相关(r=0.426、0.471,P<0.05)。血清CCL19、IRF4水平升高是UC患者预后不良的危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清CCL19、IRF4水平单独及联合预测UC患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.798、0.752、0.845。结论UC患者血清CCL19、IRF4水平均升高,且与患者病情和临床预后关系密切,可作为UC临床预后评估的潜在指标。

电针对干眼模型小鼠眼表形态结构及干扰素调节因子5的影响

目的:观察电针对干眼模型小鼠眼表形态结构和干扰素调节因子5(IRF5)的影响,探讨电针治疗干眼的作用机制。方法:取若干只雄性C57BL/6J小鼠,采用皮下注射氢溴酸东莨菪碱的方法制备干眼模型,造模成功的小鼠随机分为模型组、西药组和电针组,每组10只,另取10只健康雄性C57BL/6J小鼠作为正常组。西药组小鼠予氟米龙滴眼液滴双眼,每日3次,每次各1滴,连续14 d;电针组小鼠予电针双侧睛明和太阳穴,留针15 min,连续14 d;正常组和模型组正常饲养,不给予任何干预措施。于造模前、造模第21日和末次干预后次日分别采用角膜荧光素钠染色评分评价各组小鼠角膜上皮的损伤情况;干预结束后次日,使用角膜共聚焦显微镜观察各组小鼠角膜形态学变化,苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠角膜和泪腺组织病理形态学表现,免疫组化法检测各组小鼠角膜组织中IRF5蛋白的表达情况,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组小鼠角膜组织中IRF5 mRNA的表达。结果:模型组与西药组、电针组小鼠造模第21日角膜荧光素钠染色评分均明显高于本组造模前和同时期正常组(P<0.05),电针组和西药组末次干预后次日上述评分均明显低于本组造模第21日和同期模型组(P<0.05)。角膜共聚焦显微镜观察结果显示,模型组小鼠角膜见大量球状免疫细胞,活化的基质层细胞边界不清、大小不规则,细胞间隙不规则,神经宽度发生改变,神经分支反射率降低并呈现分支断续;电针组和西药组小鼠角膜基质层细胞形态和神经反射均有改善。HE染色病理图片显示,模型组小鼠角膜上皮细胞排列不规整,存在上皮细胞脱落,基质层胶原纤维排列不齐、肿胀;泪腺上皮细胞明显萎缩,腺腔扩张,局灶性淋巴细胞浸润。电针组和西药组小鼠角膜上皮细胞脱落和基质层胶原纤维排列情况均有改善,泪腺组织上皮细胞萎缩和淋巴细胞浸润亦得到改善。模型组小鼠角膜组织IRF5蛋白和mRNA相对表达量均明显高于正常组(P<0.01),电针组和西药组小鼠角膜组织IRF5蛋白和mRNA相对表达量均明显低于模型组(P<0.01)。结论:电针可以改善干眼模型小鼠眼表组织炎症和损伤,其作用机制可能与抑制IRF5的表达有关。

芪冬活血饮通过干扰素调节因子5抑制肺组织M1巨噬细胞募集治疗急性肺损伤的作用机制研究

目的探讨芪冬活血饮通过干扰素调节因子5(IRF5)抑制肺组织M1巨噬细胞募集治疗急性肺损伤(ALI)的作用机制。方法24只C57BL/6小鼠随机分成四组,即空白组、模型组、芪冬活血饮低剂量(1 g/mL)和高剂量(2 g/mL)组,每组6只。采用脂多糖(LPS)制备ALI模型,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肺组织病理学改变;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺泡灌洗液炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素(IL-6)]水平;采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色检测肺组织细胞凋亡情况;采用流式细胞术检测肺组织M1型巨噬细胞水平,采用蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3剪切体(cleaved caspase3)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、BCL2相关X蛋白(Bax)表达;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测肺组织IRF5 mRNA表达;采用免疫荧光法检测IRF5蛋白在肺组织中的原位表达。结果与空白组比较,模型组小鼠肺组织肺泡结构破坏,肺间质水肿增厚,炎性细胞浸润,红细胞渗出,肺组织细胞凋亡显著增加,肺泡灌洗液炎症因子水平显著提高[IL-6:(964.87±85.12)pg/mL比(83.24±8.19)pg/mL,P<0.01;IL-1β:(127.64±10.98)pg/mL比(10.37±2.98)pg/mL,P<0.01;TNF-α:(148.74±13.98)pg/mL比(12.19±2.01)pg/mL,P<0.01],cleaved caspase3、Bax蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白水平降低;M1型巨噬细胞数量显著增加,肺组织IRF5 mRNA表达增加[(3.67±0.34)比(0.98±0.09),P<0.01],IRF5蛋白表达水平显著提高;与模型组比较,芪冬活血饮低、高剂量组小鼠肺组织病理状态明显改善,肺组织细胞凋亡水平显著降低,cleaved caspase3、Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白水平增加,炎症因子水平显著降低[IL-6:(817.56±63.49)pg/mL、(529.45±45.67)pg/mL比(964.87±85.12)pg/mL,P<0.05或P<0.01;IL-1β:(83.84±7.69)pg/mL、(64.28±7.06)pg/mL比(127.64±10.98)pg/mL,P均<0.01;TNF-α:(117.22±12.30)pg/mL、(72.69±8.44)pg/mL比(148.74±13.98)pg/mL,P<0.05或P<0.01],肺组织M1型巨噬细胞数量均显著降低,肺组织IRF5 mRNA表达显著下调[(2.59±0.27)、(1.67±0.19)比(3.67±0.34),P<0.05或P<0.01],IRF5蛋白表达显著下调。结论芪冬活血饮可抑制ALI肺组织M1型巨噬细胞募集,减轻炎症反应,其机制可能与抑制IRF5有关。

模式识别受体DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DAI)的免疫学研究进展

DNA感受器是一类广泛表达于固有免疫细胞的模式识别受体(PRR),通过识别病原体或异常宿主细胞DNA激活相关炎症信号通路触发固有免疫应答。DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DAI)是首个被发现的细胞质DNA感受器,在调控以干扰素诱导和程序性细胞死亡为特征的固有免疫应答中发挥重要作用。我们总结了DAI的分子特性,下游信号通路及其在抗感染免疫、肿瘤免疫和炎症性疾病中的作用及机制,并初步探讨了DAI与移植免疫的相关性,为临床治疗多种免疫性疾病提供新的靶点。

突发性聋患者血清干扰素调节因子9和沉默信息调节因子1水平及其临床意义

目的分析突发性聋患者血清干扰素调节因子9(IRF9)和沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达情况,并探究其临床意义。方法选取2020年3月至2022年3月湖北省中医院收治的150例突发性聋患者为病例组,并同期选取150名检查健康者为对照组。分析两组对象的一般资料;采用PCR法检测两组IRF9表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测SIRT1水平;采用Pearson分析突发性聋患者血清IRF9与SIRT1的相关性;采用ROC曲线分析IRF9、SIRT1水平对突发性聋患者的诊断价值;采用logistic回归分析影响突发性聋患者的因素。结果病例组饮酒人数多于对照组,收缩压(SBP)、舒张压(DBP)高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。病例组的IRF9水平高于对照组,SIRT1水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,突发性聋患者血清IRF9和SIRT1呈负相关(r=-0.576,P<0.05)。ROC分析显示,血清IRF9和SIRT1的ROC曲线的下面积(AUC)分别为0.738(95%CI=0.681~0.796)、0.746(95%CI=0.691~0.800)二者联合检测的AUC为0.818(95%CI=0.769~0.866),高于IRF9、SIRT1单独检测。多因素回归分析显示,IRF9是影响突发性聋患者的危险因素(OR=1.604,95%CI=1.221~2.106,P<0.001),SIRT1为保护因素(OR=0.729,95%CI=0.593~0.896,P=0.003)。结论突发性聋患者血清IRF9水平升高,SIRT1水平降低,二者水平对患者的早期临床诊断有重要意义。

25-羟基胆固醇通过调控干扰素调节因子4抑制CD4^(+)T细胞IL-17的表达

目的探讨25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol,25-HC)对人外周血单个核细胞(PBMCs)产生IL-17的抑制作用及其机制。方法用抗人CD3抗体联合抗CD28抗体刺激培养外周血单个核细胞(PBMCs)和纯化CD4^(+)T细胞,加或不加25-HC进行培养,ELISA、ELISPOT和PCR检测IL-17和IFN-γ的表达;流式细胞术检测T细胞转录因子(RORγt、RUNX1和IRF4)的表达、细胞表面活化分子的表达以及T细胞分裂增殖情况。通过电转染过表达IRF4,检测其对IL-17表达的影响。结果25-HC呈时间和剂量依赖的方式抑制T细胞产生IL-17,且主要抑制CD4^(+)T细胞中IL-17的表达。进一步研究发现,25-HC抑制T细胞晚期活化分子的表达和细胞分裂增殖,抑制IL-17相关转录因子IRF4的表达;过表达IRF4后,25-HC对IL-17表达的抑制作用被恢复。结论25-HC抑制Th17细胞的活化和增殖,并通过下调IRF4的表达抑制CD4^(+)T细胞产生IL-17。25-HC可能是IL-17相关炎症性疾病的一个具有前景的调控靶点。

外周血干扰素调节因子-8和组织因子途径抑制剂-2甲基化水平可以作为肝细胞癌的早筛和预后存活的预测因子

目的探究外周血干扰素调节因子-8(IRF-8)和组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)甲基化水平对肝细胞癌的预测作用以及与预后的相关性分析研究。方法以58例肝细胞癌患者为实验组,16例体检健康者作为对照组。抽取入组者的清晨血,利用试剂盒检测血清中的IRF-8和TFPI-2的甲基化水平。同时收集患者的临床相关资料,利用Logistic回归分析肝细胞癌的易感因素,随访2年后患者的存活率,比较IRF-8和TFPI-2启动子甲基化水平与预后的关系。结果58例肝细胞癌患者外周血中发现865918个CpG位点中的2180个(0.25%)在肿瘤组织中差异甲基化。与数据库对比,发现干扰素调节因子-8(IRF-8)和组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)启动子甲基化水平变化最大。Logistic回归分析结果显示,年龄,BMI,HBsAg阳性,肝硬化病史,IRF-8甲基化水平和TFPI-2甲基化与肝细胞癌发病密切相关(P<0.05)。外周血中IRF-8启动子甲基化和TFPI-2启动子甲基化情况与年龄、HBsAg阳性、肝硬化、分化程度、淋巴结转移、浸润深度、卫星灶等呈正相关(P<0.05)。2年随访中存活患者的外周血中IRF-8和TFPI-2甲基化状态与未存活患者比较具差异有统计学意义(P<0.05)。结论外周血中IRF-8和TFPI-2甲基化水平可以作为肝细胞癌患者的早筛和预后的预测因子。

氨基末端脑钠肽前体、降钙素原及干扰素调节因子4水平变化与脓毒症患儿病情、预后的关系研究

目的:研究氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、降钙素原(PCT)及干扰素调节因子4(IRF4)水平变化与脓毒症患儿病情、预后的关系。方法:回顾性分析2018年2月—2020年6月阳江市人民医院收治的108例脓毒症患儿的临床资料作为研究组;另选取同期58例健康体检儿童作为对照组。比较不同人群、不同预后者NT-proBNP、PCT及IRF4水平,绘制ROC曲线分析上述因子水平对小儿脓毒症死亡的预测价值。结果:研究组患儿NT-proBNP、PCT水平显著高于对照组,IRF4水平低于对照组,差异有统计学意义(t=27.073、4.707、120.612,P<0.05),随着脓毒症患儿病情进展,NT-proBNP、PCT水平逐渐上升,IRF4水平逐渐降低,差异有统计学意义(F=58.84、21.92、15782.80,P<0.05)。在108例脓毒症患儿中,预后良好的患儿86例(79.63%),预后不良的患儿22例(20.37%),死亡16例。预后良好组NT-proB⁃NP、PCT水平明显低于预后不良组,IRF4水平显著高于预后不良组,差异有统计学意义(t=10.414、10.401、125.323,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,NT-proBNP、PCT及IRF4水平对脓毒症患儿死亡具有高预测价值,其中以联合检测的曲线下面积最大为0.899;单项检测中以NT-proBNP的曲线下面积最大,为0.804。结论:脓毒症患儿NT-proBNP、PCT呈高表达,IRF4呈低表达,其可能与脓毒症患儿预后、病情密切相关,对上述因子水平进行检测有助于评估患儿预后。

草鱼干扰素调节因子5的表达研究

干扰素调节因子是在研究干扰素转录调控时发现的[1]。到目前为止,在哺乳动物和鸟类中共发现10种干扰素调节因子IRF-1—10。一般认为干扰素调节因子（IRF）通过调节干扰素的表达而行使其抗病毒、应激、免疫调节等功能[2,3]。近年来,研究人员发现IRF在细胞凋亡。

干扰素调节因子6基因多态性与非综合征型唇腭裂的相关性研究

目的探讨干扰素调节因子6(IRF6)基因rs642961和rs4844880位点单核苷酸多态性与非综合征型唇腭裂的相关性。方法收集宁夏地区非综合征型唇腭裂患者186例,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测IRF6基因多态位点rs642961和rs4844880基因型,进行病例对照分析、传递不平衡检验(TDT)。结果与正常对照组比较,唇裂组和唇腭裂组rs642961和rs4844880位点的AA基因型和A等位基因的频率存在统计学差异(P<0.05),腭裂组均没有意义(P=0.15,P=0.967);TDT研究发现IRF6基因rs642961位点的A等位基因和rs4844880位点的A等位基因在唇裂和唇腭裂患者中存在过传递(P<0.05);2个位点在腭裂组均没有统计学意义(P=0.91,P=0.95)。结论 IRF6基因多态性与非综合征型唇腭裂存在较强的相关性。

干扰素调节因子5(IRF5)调控小鼠骨髓源性巨噬细胞的极化

目的诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞,检测干扰素调节因子5(IRF5)在M1型和M2型巨噬细胞中的表达差异,并用IRF5小干扰RNA(IRF5 siRNA)沉默巨噬细胞中IRF5基因表达,观察其极化状态的改变。方法用γ干扰素(IFN-γ)和脂多糖(LPS)诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化,白细胞介素4(IL-4)诱导其向M2型巨噬细胞分化,实时定量PCR检测IRF5、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、精氨酸酶1(Arg1)和巨噬细胞甘露糖受体(MMR)mRNA在M1型和M2型巨噬细胞中的表达。用IRF5 siRNA转染巨噬细胞,实时定量PCR检测M1型巨噬细胞标志物IRF5、IL-12、TNF-α、i NOS和M2型巨噬细胞标志物Arg1、MMR mRNA的表达,评估其极化状态的改变。结果流式细胞术检测巨噬细胞分化率达81.7%,实时定量PCR检测显示M1型巨噬细胞中IRF5、IL-12、i NOS mRNA的表达量明显高于M2型巨噬细胞,TNF-α亦高于M2型巨噬细胞;M2型巨噬细胞中Arg1、MMR mRNA表达量同M1型巨噬细胞比较显著增高。IRF5 siRNA转染巨噬细胞后,IRF5、IL-12、TNF-α、i NOS mRNA的表达量显著降低,Arg1、MMR mRNA的表达量明显增加。Western blot法检测结果显示IRF5、IL-12、TNF-α、i NOS蛋白的表达量显著降低,Arg1、MMR蛋白的表达量明显增加,极化状态向M2型巨噬细胞偏移。结论 IRF5对巨噬细胞的极化调控有重要作用,可作为鉴别M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的重要标志物。

干扰素调节因子的研究进展

指出了干扰素调节因子(IRFs)是一类在干扰素(IFN)信号通路中起重要调控作用的多功能转录因子,目前已经发现10个IRFs成员,它们在IFN的诱导、病毒防御、免疫调节、细胞分化、细胞生长与凋亡和许多疾病的调节中具有重要作用.对IRFs的结构、IRFs在免疫系统、细胞分化、细胞凋亡和相关疾病如肿瘤、系统性红斑狼疮中的功能作了综述.

干扰素调节因子1在呼吸道合胞病毒感染后气道神经源性炎症的调控作用

目的通过研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染后的SD大鼠气道反应性和神经源性炎症的变化及干扰素调节因子1(IRF-1)的调控作用,探讨IRF-1在调控RSV感染后调控气道神经源性炎症的作用地位。方法对4组SD大鼠(空白对照组、RSV感染组、IRF-1干扰组和IRF-1基因沉寂组)相应处理后进行气道反应性测定,取其左肺行HE染色,右肺行免疫组化检测P物质(SP)及降钙素基因相关肽(CGRP)。结果①RSV感染组与空白对照组比较:气道反应性明显增高(P<0.05),炎性细胞浸润明显增多,SP和CGRP的表达明显增多;②IRF-1干扰组与RSV感染组比较:气道反应性无明显差别(P>0.05),炎性细胞浸润及SP、CGRP的表达无明显差别;③IRF-1基因沉寂组与RSV感染组相比,气道反应性明显降低(P<0.05),炎性细胞浸润及SP、CGRP的表达明显减少。结论 IRF-1在RSV感染引起气道高反应性的过程中可能是通过参与调节神经源性炎症介质的表达来参与调控,IRF-1有望成为哮喘气道神经源性炎症一个新的治疗靶点。

肝细胞中固有干扰素调节因子7的表达及其抗病毒作用

目的:检测肝细胞中固有表达的干扰素调节因子7(IRF7)在免疫过程中的作用,揭示IRF7固有表达对肝细胞抵御病毒感染的影响。方法:以原代肝细胞、永生化肝细胞HuS-E/2以及肝肿瘤细胞株HuH-7细胞作为研究对象,利用仙台病毒(SV)感染原代肝细胞和HuH-7细胞,以RT-PCR法检测IFNα1、IFNβ、IFNλ3及视黄酸诱导基因蛋白(RIG-I)的诱导表达,以IRF7显性负性突变体表达载体pcDNA3-7DN转染HuS-E/2细胞,RT-PCR法及实时定量PCR检测上述基因的诱导变化。IRF7表达载体pcDNA3-IRF7转染HuH-7细胞后,进行2a型HCV病毒株JFH1感染,间接免疫荧光法检测HCV感染情况。结果:SV感染12 h内,HuH-7细胞中未检测到明显的IFNα1、IFNβ、IFNλ3和RIG-I的诱导表达;而在SV感染早期(3 h),原代肝细胞中即可检测到上述基因的mRNA条带。IRF7功能受到抑制后,RT-PCR结果显示SV感染的肝细胞中上述基因表达在感染早期的mRNA条带灰度降低;实时定量PCR可见SV感染3 h内,上述基因mRNA诱导表达水平均显著降低(P<0.001)。异位表达IRF7的HuH-7细胞中JFH1感染后未检测到明显的HCV信号。结论:肝细胞中固有IRF7的表达与细胞感染后的免疫反应密切相关,对于防御病毒感染起到重要作用。

干扰素调节因子3在慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞中的表达及意义

目的:探讨慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞中干扰素调节因子3(interferon regulate factor 3,IRF3)在HBV诱导的抗病毒免疫反应中的表达及作用.方法:选取HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者28例,健康对照者27例,用免疫磁珠细胞分选(MACS)法获得纯化的CD14+单核细胞,RPMI 1640培养基培养,用hGM-CSF、hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的MoDC,加入PolyI∶C刺激,获得成熟的MoDC.PolyI∶C刺激后0、12、24、48h收集细胞培养的上清液及细胞,Real-Time PCR法检测IRF3和Toll样受体3(TLR3)的表达,ELISA方法检测MoDC细胞上清液中IFN-β的浓度变化.结果:12h健康对照组MoDC中IRF3 mRNA表达水平明显升高,并达高峰与0h相比差异显著(P<0.05),24、48h表达逐渐下降.而患者组MoDC中IRF3 mRNA的表达上升不明显.24h健康对照组MoDC中TLR3表达上调显著(86.27%±14.74%vs70.78%±11.16%,P<0.05),48hTLR3表达与0h相比无显著性差异,而患者组0、12、24hTLR3表达上调不明显,48hTLR3表达上调显著(85.46%±6.87%vs69.17%±20.43%,P<0.05).健康对照组IFN-β mRNA表达及细胞上清液中的浓度与0h相比显著升高(P<0.05),较患者组0、12、24和48hIFN-β的表达显著升高(P<0.05).结论:HBV慢性感染患者在感染病毒后不能激活IRF3从而导致宿主不能分泌足够的IFN-β以清除病毒,这可能是HBV慢性持续感染的原因之一.

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1(+)中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。

牙鲆干扰素调节因子核心区序列的克隆及初步表达

采用逆转录—聚合酶链式反应 (RT -PCR)方法 ,从牙鲆 (Paralichthysolivaceus)肝脏总RNA中扩增出干扰素调节因子 (fIRF)的核心区序列。定向插入质粒 pUC18,克隆的牙鲆IRFcDNA序列分析表明 ,与Yabu报道的牙鲆IRFcDNA相比有 1个碱基差异 ,但与推断的氨基酸序列完全一致。将牙鲆IRF的核心区序列cDNA定向插入原核表达载体 pBV2 2 0 ,构建成牙鲆IRF表达载体pBVfIRF2 2。SDS -PAGE分析表明 ,经 4 2℃诱导 ,含 pBVfIRF2 2质粒的大肠杆菌可表达一分子量约 12 0 0 0的特异蛋白。

鸡干扰素调节因子7的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达鸡干扰素调节因子7蛋白并制备其多克隆抗体,通过RT-PCR技术扩增chIRF7基因的编码序列,构建重组质粒PET30a-chIRF7。将重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rchIRF7分子量约为60ku。将纯化的重组蛋白免疫接种小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA测定血清抗体滴度在1∶51 200以上,IFA检测结果显示制备的鼠抗chIRF7蛋白多抗能够与AIV刺激的CEF细胞内的chIRF7蛋白发生特异性反应,表明通过原核表达系统表达的重组蛋白rchIRF7具有很好的免疫原性,以其制备的鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体滴度高、特异性好。