HMGN2基因干扰质粒构建及干扰效率测定

目的:构建HMGN2基因的干扰质粒,为深入研究HMGN2基因在信号通路中的作用提供有效手段。方法:根据文献选择两个HMGN2基因的干扰位点,合成两个干扰片段定向克隆到psilencer-4.1的干扰载体并测序验证。将干扰质粒转染至A549细胞,并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果:RT-PCR产物检测结果显示干扰质粒psilencer-4.1-HMGN2-2干扰效率最高,其HMGN2表达量降低了70%左右。结论:成功构建了对HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4.1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。

Fas靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建Fas靶向的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制Fas表达在急性再生障碍性贫血治疗中的意义奠定基础。方法 PCR法获得U6启动子序列以及产生siRNA的相应DNA模板序列,将其克隆入改造后的pcDNA3.1,获得RNA干扰载体pU6 siFas。脂质体法将pU6 siFas导入P815 细胞,免疫组化法检测对P815 细胞Fas表达的抑制情况。结果 所构建的载体pU6 siFas能够干扰P815细胞中Fas的表达,并且具有新霉素抗性,能够用G 418 筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了抑制小鼠Fas表达的RNA干扰质粒载体。

质粒载体系统介导的人肿瘤细胞RNA干扰作用

目的研究质粒载体介导的肿瘤细胞RNA干扰效果.方法构建以H1 RNA为启动子的针对GFP基因不同序列片段的RNAi质粒pLasRiGFP1/2/3.将其与pcdna3.1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞或单独转染SPCA1-GFP,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析GFP表达.结果 pLasRiGFP1、pLasRiGFP2和pLasRiGFP3在HEK293中对GFP表达的抑制率分别为97.5%、97%和89%,Hela细胞中为83%、90%和90%,SPCA1细胞中为65%、55%和40%.pLasRiGFP1与pLasRiGFP2在SPCA1-GFP细胞对GFP的抑制率分别为53%和58%.RNAi作用在48～96 h最强,并随RNAi质粒增加抑制效果呈增强趋势,但到达一定量后作用趋势平缓.结论 H1 RNA为启动子的RNAi质粒能有效介导肿瘤细胞RNAi,其作用存在剂量和时间效应,受靶序列、细胞类型等因素的影响.

VEGF靶向RNA干扰质粒构建及其对人舌鳞癌Tca8113细胞的影响

目的:用RNA干扰技术阻断人舌鳞癌系Tca8113细胞中VEGF基因的表达,观察细胞增殖及凋亡特征。方法:检测人舌鳞癌系Tca8113细胞中血管内皮生长因子VEGF表达水平;采用真核转录质粒pRNA-U6.1/Neo构建针对VEGF基因的重组转染质粒。将4种不同序列的VEGF-shRNAV1、VEGF-shRNAV2、VEGF-shRNAV3、VEGF-shRNAV4质粒以及含与VEGF无关序列的VEGF-shRNAVc和空白质粒VEGF-shRNAU6分别转染Tca8113细胞,48h后检测其VEGF表达水平,筛选稳定转染RNAi-VEGF的细胞;CCK8检测其增殖能力;流式细胞仪检测其细胞周期;Anexin-V-PI检测其凋亡特征。结果:RT-PCR和Western blot检测:Tca8113细胞阳性表达VEGF;用Lipofectamine 2000成功将不同VEGF片段的质粒转染入Tca8113细胞;RT-PCR发现,VEGF-shR-NAV2组细胞VEGF表达被显著抑制,用400ng/mLG418压力筛选获得VEGF稳定被抑制的细胞系;CCK8检测各组Tca8113细胞增殖见VEGF-shRNAV2组增殖能力小于VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组;转染VEGF-shRNAV2的Tca8113细胞G0-G1期细胞较VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组高,且细胞凋亡多。结论:用RNA靶向干扰能明显降低人舌鳞癌Tca8113细胞内VEGF的表达并抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡。

鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测鸡γ干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ干扰素（ChIFN-γ）和鸡的28 S rRNA（Ch28 S）基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ.结果表明：ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102～1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,γ2均大于0.99.此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点.

猪γ-干扰素基因真核重组表达质粒的构建

用 RT- PCR方法从长白猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪 γ-干扰素 (IFN- γ)基因 ,经克隆测序表明与已发表序列同源性为10 0 %。将目的基因插入表达载体 pc DNA3.1(+) ,构建出真核重组表达载体 IFN-γ- pc DNA。将重组质粒转染 COS7细胞 ,检测转染细胞培养上清 IFN- γ活性 ,结果表明转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒有抑制作用。

HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。

UNC5B基因靶向shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的:探讨人UNC5B基因的双链RNA在体外对UNC5B表达的干扰作用及其规律。方法:构建两个能产生UNC5B的发夹状RNA(shRNA)的质粒载体Pgenesil-UNC5B1及Pgenesil-UNC5B2作为实验组,并构建无关序列shRNA表达质粒Pgenesil-NC作为阴性对照,将3种质粒分别转染脐静脉内皮细胞(HUVEC)。转染24h后,荧光倒置显微镜下观察质粒转染效率,用G418筛选得到稳定转染的细胞,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测UNC5B在HUVECs中的表达情况。结果:转染24h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,转染效率约为40%～50%。实验组经G418筛选后稳定转染的细胞UNC5BmRNA均受到抑制,两种UNC5B基因靶向shRNA表达质粒对HUVECs中UNC5B抑制率分别为88%和52%。结论:本研究所构建的UNC5BshRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制UNC5B的表达,为进一步实验奠定了基础。

VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建干扰血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因RNA表达的重组质粒。方法设计3组针对VEGF基因的核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果 DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1(-)中的序列正确,双酶切证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1(-)。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。

靶向bcl-2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

目的构建针对bcl-2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体,转染到bcl-2基因高表达的胃癌细胞株SGC-7901中,并筛选出稳定低表达bcl-2基因的细胞株。方法针对bcl-2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列,插入质粒载体pGPH1/GFP/Neo中,经脂质体介导转染SGC-7901细胞。RT-PCR检测bcl-2基因在mRNA水平的变化,MTT法检测bcl-2基因沉默后胃癌SGC-7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果与对照组相比,转染成功后的细胞bcl-2基因在mRNA水平均显著下降,细胞增殖速度明显降低(t=2.41,P<0.05);并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl-2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl-2基因的SGC-7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。

人干扰素α高效表达质粒pEE14.1-IFN-α的构建和表达

目的:构建人干扰素α的高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,并在真核细胞中验证其表达。方法:通过PCR获得人IFN-α基因,连入过渡载体pCI-GPI,然后克隆入高效表达载体pEE14.1中,构建重组表达质粒pEE14.1-IFN-α。瞬时转染293T细胞后48 h收获上清,采用ELISA,Western blot分别验证目的基因表达。结果:pEE14.1-IFN-α经酶切和测序分析,与预期设计完全一致,表明重组质粒构建成功。ELISA法检测瞬时转染细胞上清中α干扰素含量,浓度约为3.15 ng/mL,说明表达的蛋白有免疫活性,Western blot检测也显示该重组质粒在上清中分泌表达。结论:成功构建高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,为慢性乙肝免疫治疗提供新的备选方案。

TNFAIP8干扰质粒的构建及最佳干扰效率质粒的筛选

目的:构建并筛选出干扰效率最佳的TNFAIP8-shRNA-p SIREN-Retro Q干扰质粒。方法:通过生物软件选择3个TNFAIP8基因干扰位点,构建干扰质粒并测序验证,将干扰质粒及对照质粒分别转染至A549细胞,通过RT-PCR、Western blot检测干扰效率。结果:经RT-PCR和Western-Blot证实TNFAIP8-shRNA-p SIREN-Retro Q干扰质粒能有效干扰并抑制细胞内TNFAIP8基因的表达,通过流式检测发现降低TNVAIP8表达可以提高细胞对a DR5Sc Fv诱导凋亡的敏感性。结论:成功构建和设计了对TNFAIP8基因具有显著干扰效率的干扰质粒,为进一步研究TNFAIP8基因的功能奠定了基础。

Nogo-66受体RNA干扰质粒的构建及其干扰效率鉴定

目的构建及筛选高效率针对Nogo-66受体(Nogo-66receptor,NgR)进行RNA干扰(RNAi)的质粒。方法RT-PCR克隆NgR,插入表达质粒中,构建NgR-GFP融合蛋白表达质粒。根据NgR序列,设计4对针对NgRmRNA进行RNAi的寡核苷酸。退火后,插入短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达质粒中,构建shRNA表达质粒。将NgR-GFP融合蛋白表达质粒与shRNA表达质粒共转染AAV-293细胞。通过对GFP表达量的观察及Westernblotting定量检测NgR-GFP融合蛋白表达量,鉴定shRNA表达质粒对NgR的干扰效率。结果针对NgR进行RNAi的4个序列中,有1个序列的干扰效率大于90%以上。结论成功构建了1个针对NgR的高效RNAi表达质粒。

人β-干扰素重组质粒在CHO-dhfr^-细胞中表达水平与MTX的关系

人IFNβ基因编码序列与pSC_7-dhfr^-载体重组构建的由SV_(40)早期启动子控制的组成性表达cDNA克隆,转染CHO-dhfr^-细胞,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压,观察其表达情况。二氢叶酸还原酶(dhfr)有一特性,其基因拷贝数可在MTX的选择压力下扩增,

大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。

猪繁殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因半定量RT-PCR方法的建立及其在RNA干扰研究中的应用

为了建立以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法,根据PRRSV VR2332株病毒基因组和GAPDH序列设计4对特异性引物,分别扩增GP5、M、N和GAPDH基因序列,将shRNA表达质粒和GP5、M、N真核表达质粒共转染HEK293A细胞,应用该法检测了转染孔中GP5、M、N的相对表达量。同管和分管扩增法均建立了以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法。靶向GP5、M和N蛋白基因的shRNA表达质粒对其各自蛋白的抑制率为36%～69%,其中pSi-N3和pSi-G1抑制效果最为显著。结果表明,建立的半定量RT-PCR可以用于PRRSV主要结构蛋白基因表达水平的检测分析中。

构建并检测以人U6 snRNA为启动子的RNA干扰质粒载体

目的:应用人U6启动子构建RNA干扰载体pUC19NU,具有新霉素抗性且能够在真核细胞中复制,成为基因功能和基因治疗研究等领域的RNA i技术的工具。方法:通过PCR从人类基因组中得到人U6 snRNA启动子,并针对增强绿色荧光蛋白(EGFP)和p53蛋白的基因,分别设计了两段可以转录出短发夹环状RNA的DNA模板序列,连入pUC19中,构建出RNA干扰质粒pUC19NU,分别得到质粒载体pUC19NUE和pUC19NUP。结果:以EGFP和p53为靶基因的干扰实验证明,两种质粒载体分别转染HeLa细胞和KMB-17细胞,两种蛋白的表达皆受到有效抑制。结论:该质粒能够有效地干扰相应内源性和外源性靶基因的表达,可以用于RNA i技术的研究。

肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究

目的构建以大鼠CTGF和TIMP-1基因为靶点的双重RNA干扰表达载体质粒,以检测其转染肝星状细胞的效率。方法筛选出对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,各设计1对含有短发夹结构的RNA干扰靶点序列,分别克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CT-GF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1),进行酶切和测序鉴定。将构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染大鼠肝星状细胞,在荧光显微镜下观察质粒转染情况,用流式细胞仪检测转染效率。结果酶切与测序结果提示重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiR-NA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com成功构建;成功将重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com转染肝星状细胞,在24小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF+TIMP-1组转染效率分别为15±2%、13±1%、15±1%和14±2%,均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组(Com组,20±2%,P<0.05);在48小时,空质粒组、CTGF组、TIMP-1组和CTGF+TIMP-1组转染效率分别为10±2%、9±1%、8±2%和10±1%,均低于Com组的15±2%(P<0.05)。结论成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的双重RNA干扰表达质粒,能转染至肝星状细胞,并且psiRNA-GFP-Com转染效率最高。

RNA干扰HESR1基因质粒体的构建

目的:构建HESR1基因的RNA干扰(RNAi)载体。方法:根据人HESR1的基因序列设计短双链两条,人工合成后,连接到RNAi-ReadypSIREN-RetroQZsGreenVector载体中,构成两个HESR1/RNAi重组质粒,转入内皮细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两质粒对HESR1表达的影响,以确定HESR1/RNAi重组质粒进行下一步研究。结果:两质粒都有沉默HESR1基因的作用,1号作用更强烈一些,确定使用1号pSIREN/HESR1质粒进行下一步研究。结论:HESR1/RNAi重组质粒的成功构建,为下一步研究奠定基础。