RNA干扰Survivin基因沉默对卵巢癌SKOV3及SKOV3/ADM细胞凋亡的影响

背景与目的:RNA干扰技术被广泛应用于肿瘤基因治疗、抗病毒感染、基因药物筛选等许多领域。Survivin基因在卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药株SKOV3/ADM中高表达,是进行卵巢癌基因治疗理想的靶点。本研究探讨Survivin基因沉默后对卵巢癌细胞SKOV3及其耐药株SKOV3/ADM凋亡的影响。方法:将重组质粒pshRNA鄄Survivin以脂质体转染至SKOV3、SKOV3/ADM细胞。分别用半定量RT鄄PCR、Westernblot检测细胞内SurvivinmRNA和蛋白表达的变化,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)染色法、TUNEL及流式细胞仪检测重组质粒诱导细胞凋亡的情况。结果:转染pshRNA鄄Survivin后,SKOV3、SKOV3/ADM细胞中SurvivinmRNA拷贝数明显减少,抑制率分别为83.79%和91.56%,蛋白质的表达水平显著降低;干扰组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,Survivin沉默后48h,SKOV3、SKOV3/ADM的细胞凋亡率分别为14.05%和21.02%,而在对照组未检测到明显凋亡。结论:重组质粒pshRNA鄄Survivin可明显抑制SKOV3、SKOV3/ADM细胞内SurvivinmRNA和蛋白的表达,介导卵巢癌细胞凋亡。

RNA干扰survivin基因在EC109细胞中作用的体内实验研究

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体内增殖的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体,转染EC109细胞,筛选得到稳定细胞克隆。同时设非特异siRNA载体转染为对照;通过裸鼠移植瘤模型的成瘤时间、瘤结节重量,比较各组细胞在体内的增殖速度;免疫组织化学染色检测移植瘤的细胞凋亡。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞组在裸鼠体内成瘤时间为(8.86±1.069)d,高于其它各组;平均瘤重为(0.32±0.12)g,低于其它组,均有显著差异(P<0.05);TUNEL法细胞凋亡检测,siRNA-survivin转染的EC109细胞组的凋亡指数为(10.52±4.35),高于其它组,具有显著性差异(P<0.05);结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体内增殖的作用,诱导细胞的凋亡是其重要作用机制。

特异性干扰survivin基因表达对人舌癌Tca8113细胞体外增殖和侵袭性的影响

目的:探讨应用RNAi技术特异性沉默survivin基因表达对人舌癌细胞Tca8113增殖、凋亡、迁移的影响,阐明survivin在Tca8113细胞生物学行为中的作用。方法:取对数生长期的Tca8113细胞,分为干扰组、阴性对照组及空白对照组。采用RT-PCR和Western blot方法检测Tca8113细胞中survivin基因的mRNA及蛋白的表达水平;MTT法检测细胞的增殖状况;流式细胞术检测各组Tca8113细胞凋亡率;划痕实验检测Tca8113细胞的迁移状况。结果:RT-PCR显示舌癌Tca8113细胞中survivin的mRNA表达水平明显低于空白对照组(P<0.05),Western blot蛋白免疫印迹结果显示,与空白对照组比较,survivin蛋白表达水平减少(P<0.05)。survivin干扰组Tca8113细胞的增殖能力降低(P<0.05);细胞划痕实验发现转染Tca8113细胞48 h后干扰组细胞的迁移距离明显短于空白对照组(P<0.05)。结论:特异性沉默siRNA-survivin的表达可有效抑制舌癌Tca8113细胞的体外迁移能力,可能与survivin表达减少有关,有望成为口腔舌癌生物治疗的潜在靶点。

RNA干扰survivin基因对K562细胞化疗敏感性的影响及机制

目的应用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制survivin基因的表达,观察其对K562细胞化疗敏感性的影响,为临床白血病治疗提供理论依据。方法实验分为RNA干扰组、脂质体对照组、空白对照组。转染48h后用RT-PCR法,免疫组化法分别检测survivin在mRNA及蛋白水平的表达;MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性;流式细胞仪检测细胞内阿霉素的药物浓度;免疫组化法检测K562细胞中3种耐药相关蛋白P-gp、TOPO-2、GST-π的表达。结果①RNA干扰组K562细胞的survivin基因表达水平明显下降;②RNA干扰组K562细胞对阿霉素敏感性增高;③RNA干扰组K562细胞中阿霉素浓度增高;④RNA干扰组K562细胞耐药蛋白GST-π表达水平下降,而P-gp,TOPO-2的表达与对照组比较无显著差异。结论特异性siRNA能够有效抑制survivin基因的表达,并可能通过降低耐药蛋白GST-π的表达增加K562细胞对阿霉素的敏感性。

RNA干扰survivin基因对人食管癌EC109细胞体外增殖和化疗敏感性的影响

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体外增殖和化疗药物敏感性的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体,转染EC109细胞,筛选得到稳定细胞克隆。同时设空载体和构建非特异siRNA载体转染为对照;MTT法检测各组细胞的体外增殖速度和比较它们对化疗药物顺铂的敏感性;流式细胞仪检测各组细胞的周期变化。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞体外增殖受到抑制;不同浓度顺铂对各组细胞的增殖有抑制作用,且呈剂量依赖性。siRNA-survivin转染的EC109细胞的IC50为1.0188μg/mL,低于其他组(P<0.05);siRNA-survivin转染的EC109细胞组细胞周期明显阻滞于G0/G1期(P<0.05),S期比例也低于其他组(P<0.05)。结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体外增殖和提高细胞对化疗药物顺铂敏感性的作用,将更多细胞阻滞在G0/G1期是其重要的作用机制。

RNA干扰survivin基因提高淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性

目的:探讨RNA干扰下调Burkitt淋巴瘤Daudi细胞系凋亡抑制基因survivin的表达对阿霉素敏感性的影响。方法:构建survivin发夹RNA(shRNA)真核表达载体,脂质体介导转染Daudi细胞。多重RT-PCR检测survivin mRNA表达;Western blotting检测Survivin蛋白表达;流式细胞仪(FCM)检测干扰前后细胞凋亡率;MTT法检测干扰前后细胞对化疗药物阿霉素(adriamycin,ADR)敏感性变化。结果:与无功能control-shRNA处理组和PBS处理组比较,转染survivin-shRNA细胞的survivin mRNA和蛋白表达率显著降低,抑制率分别为62.32%和61.88%(P<0.05);FCM结果示转染组细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)显著高于两对照组(P<0.05);MTT结果显示,转染组细胞的阿霉素半数抑制浓度(IC50)为(0.25±0.43)μmol/L,显著低于无功能control-shRNA处理组(0.87±0.21)μmol/L和PBS处理组(0.91±0.36)μmol/L,P<0.05;相同剂量ADR对转染细胞的生长抑制率明显高于PBS组和control组。结论:发夹RNA干扰survivin基因可显著提高Daudi细胞凋亡率和对化疗药物阿霉素的敏感性。

RNA干扰survivin基因增强SKBr-3细胞对多柔吡星敏感性的体外研究

目的探讨抑制survivin基因的表达对人乳腺癌SKBr-3细胞化疗敏感性的影响。方法构建针对survivin基因序列特异性shRNA的表达载体,脂质体转染SKBr-3,G418筛选阳性克隆。实验分为RNA干扰组(S1&P),脂质体对照组(H1&P)和空白对照组。光镜观察转染后细胞的形态变化;0.5μg/ml多柔吡星作用于转染后的细胞,电镜观察细胞形态学变化;TUNEL染色、AnnexinV荧光标记检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖的抑制率。结果成功构建具有新霉素抗性的靶向survivin的序列特异性shRNA表达载体,基因测序完全正确;转染后干扰组细胞均发生细胞凋亡的形态学改变;低剂量多柔吡星诱导后,TUNEL染色结果 ,S1&P组凋亡细胞比例(23.6±4.8)%明显高于H1&P组(4.1±1.1)%和空白对照组(3.2±1.4)%(P<0.05),表明转染了RNA干涉载体的SKBr-3细胞对低剂量多柔吡星的敏感性显著增加;Annexin-V染色结果 :空白对照组凋亡比例为(17.43±3.12)%,H1&P组为(20.51±4.67)%,S1&P组为(68.76±8.49)%,后者与前两者比较均有统计学差异(P<0.05)。干扰组细胞凋亡率、细胞增殖的抑制率均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论体外实验证实抑制survivin基因的表达可提高乳腺癌SKBr-3细胞对多柔吡星的敏感性。

RNA干扰survivin基因靶向治疗大肠癌

目的:通过RNA干扰观察其对suivivin及PTEN在大肠腺癌中表达的差异及对大肠腺癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:将survivin siRNA用脂质体2000转染SW620细胞,以荧光定量PCR仪检测survivin和PTEN mRNA的变化,Western蛋白印迹法半定量检测两者的蛋白变化,同时用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期分布的变化.结果:结肠腺癌SW620中免疫组化染色显示survivin呈阳性表达.siRNA作用于SW620细胞,survivin mRNA及蛋白的表达随着作用时间的延长而下调,PTEN mRNA及蛋白的表达随着作用时间的延长而呈现递增趋势,在12 h,24 h,48 h,survivin mRNA分别下调为对照组的75%,93.75%,97.8%,PTEN mRNA较对照组上调41%,100%,128%,均与对照组有显著性差异.MTT法检测siRNA干扰对细胞增殖的影响呈现出时间依赖性,与对照组相比有显著性差异(P<0.05),且作用各时间点之间比较亦有显著性差异(P<0.05).流式细胞仪检测细胞的凋亡率随时间的延长而增加.结论:survivin siRNA作用于结肠腺癌SW620可使survivin mRNA和蛋白的表达下调,同时使PTEN的表达上调,两者呈负相关,同时抑制细胞的增殖及促进细胞发生凋亡.

siRNA干扰survivin表达对腺样囊性癌细胞株ACC-M的抑制作用

目的探讨靶向survivin基因RNAi对腺样囊性癌增殖的抑制效应。方法设计、合成siRNA(small interfering RNA),构建表达载体pGenesil-shRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-M细胞株。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western-blot法分别检测转染后的ACC-M细胞中survivin mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法来检测细胞的增殖。结果测序证实表达载体构建成功,在pGenesil-shRNA-survivin的ACC-M细胞株中,survivin mRNA及蛋白表达明显降低,ACC-M细胞增殖受到抑制。结论pGenesil-shRNA-survivin重组质粒能有效抑制腺样囊性癌细胞增殖。

RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase-3酶活性的影响

目的观察RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase-3酶活性的影响。方法针对survivin mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建shRNA重组质粒,转染Hela细胞,筛选获得转染效率最高的阳性克隆,阴性对照为阳性克隆随机打乱序列。Western blot方法检测survivin蛋白表达,分光光度法检测caspase-3酶活性。结果干扰48 h时,siRNA-168载体干预组干预效果最好,siRNA阳性质粒干扰组(实验组)survivin蛋白表达量为阴性对照组中survivin蛋白表达量的13%,是空白组survivin蛋白表达量的16%。干扰后caspase-3活性表达升高,实验组与阴性对照组、实验组与空白组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论siRNA可有效抑制Hela细胞survivin蛋白表达,升高caspase-3酶活性。

RNA干扰Survivin基因对Hela细胞凋亡及抗肿瘤药物敏感性的影响

目的:研究RNA干涉Survivin基因表达对人宫颈癌Hela细胞凋亡及抗肿瘤药物敏感性的影响.方法:将Sur-vivin SiRNA片段通过脂质体的介导转染宫颈癌Hela细胞系;RT-PCR检测Hela细胞中Survivin mRNA的表达,Western Blot检测Survivin蛋白表达;确定转染成功使干扰组细胞Survivin表达下调后,以流式细胞仪检测细胞凋亡率变化;细胞计数后绘制生长曲线观察细胞增殖能力变化;MTT法检测细胞对抗肿瘤药物的敏感性变化.结果:与对照组相比,两个Survivin基因干扰组的mRNA和蛋白表达抑制率分别为55%,60%和42%,55%,表达均下降(P<0.05);细胞凋亡率分别为19%和22%,较对照组高(P<0.05);生长曲线显示干扰组的细胞增殖能力下降;同一剂量药物作用下,各组细胞对抗肿瘤药物的敏感性均有提高,其中NVB组和PDD组有统计学意义(P<0.05).结论:Survivin SiRNA片段转染进入Hela细胞后,Survivin mRNA和蛋白表达水平均下降,Hela细胞的凋亡率增加,对抗肿瘤药物的敏感性增加.

RNA干扰Survivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展

Survivin(生存素)作为IAP家族成员之一,被认为是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子.以siRNA干扰Survivin的表达靶向观察其对大肠癌细胞基因的表达及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制.

RNA干扰survivin对口腔表皮样癌细胞株KB生长的抑制作用

目的探讨RNA干扰技术沉默survivin基因对口腔表皮样癌细胞株KB增殖和凋亡的影响。方法化学合成靶向survivin基因的小干扰RNA片段(siRNA),脂质体法转染KB细胞。通过RT-PCR、蛋白印迹法分别检测survivin mRNA和蛋白表达变化,流式细胞仪检测细胞生长周期和凋亡,MTT法检测转染后KB细胞增殖情况。结果 siRNA可以有效地降低KB细胞survivin mRNA和蛋白的表达;转染后KB细胞阻滞于G2/M期,凋亡增加,增殖受抑制。结论应用RNA干扰技术沉默survivin在KB细胞中的表达可以有效抑制该细胞增殖、促进癌细胞凋亡,将survivin作为口腔癌基因治疗的靶点,通过RNA干扰技术对口腔癌进行基因治疗具有一定的可行性。

RNA干扰survivin表达对喉癌细胞系Hep-2对紫杉醇敏感性的影响

目的探讨运用RNA干扰技术阻断喉癌细胞系Hep-2中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后Hep-2对紫杉醇敏感性的影响。方法化学合成21bp目的基因siRNA片段,并将不同浓度的siRNA用脂质体法转染喉癌细胞系Hep-2。用空脂质体和GFP-siRNA作平行对照。通过蛋白印迹法检测survivin表达量的变化,MTT法检测转染后Hep-2细胞对紫杉醇敏感性的变化。结果25nM和50nM的siRNA可以有效地阻断了Hep-2细胞survivin蛋白的表达;转染后Hep-2细胞在体外对紫杉醇的敏感性增加。结论初步阐明survivin在喉癌细胞对紫杉醇敏感性中的作用,为进一步探讨survivin基因与喉癌的关系以及联合治疗研究奠定了基础。

干扰survivin表达减少肿瘤细胞对紫外线诱导DNA损伤的修复作用

目的:研究生存素(survivin)对紫外线(UV)诱导的肿瘤细胞DNA损伤修复作用及其机制。方法:本研究构建和包装survivin蛋白shRNA慢病毒载体;依据逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法确定干扰效果;采用宿主细胞复活法(HCR)检测survivin蛋白表达对细胞整体DNA损伤修复能力的影响。结果:干扰survivin的表达显著降低肺腺癌H1299细胞对UV诱导DNA损伤的修复能力。结论:Survivin在UV诱导DNA损伤的修复作用中扮演重要角色。本研究可以为以survivin为靶点的肿瘤治疗提供一定的理论依据。

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响。方法实验分3个组:siRNA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞。于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况。结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降(P<0.05);Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调。结论导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞survivin蛋白表达量下降。

SiRNA靶向干扰survivin基因对舌癌细胞系Tca8113侵袭性的影响

目的应用RNAi技术抑制人口腔鳞癌细胞株Tca8113中survivin基因的的表达,观察survivin基因对Tca8113细胞增殖与凋亡的影响。方法化学合成靶向人类survivin基因的特异性si RNA,将其转染至Tca8113细胞中,采用RT-PCR法检测转染后Tca8113细胞中survivin的m RNA表达,应用MTT方法检测细胞的增殖状况,采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果 survivin靶向si RNA转染细胞后survivin基因的m RNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),细胞增殖能力降低,凋亡增多。结论通过RNAi技术阻断Tca8113细胞survivin基因的表达可抑制细胞增殖并促进细胞的凋亡。

RNA干扰Survivin基因在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的作用

目的利用RNAi技术沉默人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞Survivin基因。方法应用RNAi技术,以pGCsi/U6质粒为载体构建Survivin-siRNA重组质粒,体外转染SH-SY5Y细胞,通过RT-PCR检测Survivin基因的表达。结果重组质粒转染SH-SY5Y细胞后其生长明显受抑制;Survivin基因的表达明显低于对照组(P<0.01),达到了抑制效果。结论 RNAi可明显降低人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中Survivin基因的表达,从而抑制细胞生长,促进凋亡。

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因3个不同靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测survivin基因mRNA表达水平。选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后,免疫细胞化学法(ICC)检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况。结果与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性(F=18.64,q=4.293～4.925,P<0.05),而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性(q=0.631～0.126,P>0.05)。转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调(F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01),其增殖能力较对照组显著下降(F=20.06～47.65,q=11.186、12.601,P<0.01)。结论构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-sur-vivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖。

RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性影响

目的探讨RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387。设置空白对照组(不加载体)、阴性对照组(加入pshRNA-survivin-NC)及siRNA转染组(加入pshRNA-survivin-387),用脂质体2000转染HepG2细胞,采用逆转录聚合酶链反应技术检测各组survivin基因mRNA表达水平。分别设置空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组、siRNA转染+X线照射组,收集各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果 siRNA转染组survivin基因mRNA表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有显著性(F=218.93,q=17.73、18.66,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞凋亡率明显高于其他各组,差异有显著性(F=1 421.83,q=13.81～57.48,P<0.05);siRNA转染组及X线照射组与空白组、阴性组比较,细胞凋亡率也明显提高(q=17.55～39.10,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞存活分数显著低于其他各组(F=2870.58,q=15.32～72.51,P<0.05);siRNA转染组及单纯X线照射组细胞存活分数与空白对照组、阴性对照组比较也明显降低(q=11.14～73.90,P<0.05)。结论 pshRNA-survivin-387转染能抑制survivin基因表达,诱导肝癌细胞凋亡,增强肝癌细胞的放射敏感性。