大鼠早期心肌缺血干燥综合征抗原B基因及其蛋白的表达

目的探讨干燥综合征抗原B基因(SSB)及其蛋白在大鼠早期心肌缺血组织中的表达。方法健康SD大鼠随机分为手术组、非手术对照组和假手术组,根据缺血时间分为0min、15min、30min、60min、120min和240min亚组,依据缺血部位将手术组又分为心肌缺血组和心肌非缺血组。手术组每亚组6只大鼠,非手术对照组及假手术组中的每亚组4只。通过实时荧光定量PCR测定每个样本SSB基因的表达水平,运用Western blot和免疫荧光技术检测SSB蛋白的表达。结果 SSB基因表达在急性心肌缺血早期呈下调趋势,心肌缺血120min组SSB mRNA表达降低,与0min组及非手术对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);与心肌缺血0min组相比,SSB蛋白在心肌缺血60min组的组织中的表达降低(P<0.05);心肌缺血60min和120min,SSB蛋白在非缺血组中的表达高于缺血组(P<0.05)。缺血心肌组织中,SSB蛋白主要位于心肌细胞核,胞浆及部分心肌细胞的细胞膜上也有少量表达。结论 SSB在急性心肌缺血后呈现差异性表达,可能参与早期缺血心肌的病理生理过程。

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B（SS—B）抗原。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母菌表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近；pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000，高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平，表达量占分泌总蛋白的60％以上，产物浓度为800～900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。

人干燥综合征B抗原的基因克隆及融合表达

目的:建立新的检测方法,克隆并表达人干燥综合征B抗原(SS-B)。方法:应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从HL-60细胞株中克隆SS-B全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(W estern b lot)试验。结果:PCR产物约为1 200 bp,与预期1 224 bp接近,测序结果与Gen-Bank报道的完全一致。pGEX-5T-SS-B重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和W estern b lot结果显示融合蛋白相对分子质量为71 000,具有天然SS-B的免疫原性。结论:成功克隆表达SS-B,为下一步研究奠定了基础。

抗核抗体谱联合唇腺活检对干燥综合征的诊断价值

目的探讨抗核抗体(ANA)、抗干燥综合征(SS)抗体(包括抗SSA和抗SSB)、抗Ro-52以及唇腺活检病理联合检测对SS患者的诊断价值。方法采集2015年9月—2019年9月曲靖市第二人民医院76例门诊及住院确诊SS患者的血清标本,分别采用间接免疫荧光法(IIF)检测ANA,采用线性免疫印迹法(LIA)检测抗SSA、抗SSB和抗Ro-52,并对所有受检者进行唇部小唾液腺活检。观察各项临床评价指标的阳性率,分析单项或联合检测对SS的诊断价值。结果共纳入SS患者血清标本76份。单项检测显示,ANA、抗SSA、抗SSB、抗SSA/SSB、抗Ro-52和唇腺活检的阳性率分别为90.79%(69/76)、76.31%(58/76)、71.05%(45/76)、15.78%(12/76)、68.42%(52/76)和84.21%(64/76)。联合检测显示,ANA联合抗SSA、ANA联合抗SSB、ANA联合抗Ro-52的阳性率均为100.0%,ANA联合唇腺活检的阳性率最低(80.3%),抗SSA联合抗SSB的阳性率为97.4%,抗SSB联合抗Ro-52的阳性率为94.7%。结论ANA联合ANAs、唇腺活检可作为自身免疫性疾病SS诊断较好的初筛指标,抗SSA联合抗SSB双阳性对SS具有较高的临床诊断价值。

人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达

目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达研究

目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人干燥综合征B抗原(SS-B)。方法:PCR扩增SS-B基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SS-B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法(immunodot)鉴定。结果:PCR产物约为1200 bp,与预期1224 bp接近,pPIC9k-SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的分子量约48 000,高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的,表达量占分泌总蛋白60%以上,产物浓度为800- 900mg/L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS-B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论:SS-B在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础。

胎儿超声心动图诊断自身抗体相关的先天性心脏传导阻滞的研究进展

自身抗体相关的先天性心脏传导阻滞与母体抗干燥综合征抗原A、抗干燥综合征抗原B抗体阳性均相关,该病病情进展迅速,严重的房室传导阻滞患儿死亡率较高,大多患儿需植入永久起搏器,早期准确诊断对改善患儿预后具有重要的临床意义。本文就自身抗体对心脏的影响、自身抗体相关的先天性心脏传导阻滞发病特点和胎儿超声心动图诊断的研究进展进行综述。