干血斑用于新生儿遗传代谢病筛查的方法学进展

新生儿遗传代谢病是一类由于单基因缺陷引起代谢途径阻断而导致一系列临床症状的疾病。新生儿足跟血干血斑制备简便、安全、稳定性好，在遗传代谢病筛查不同方法学中均具有较强实用性。随着筛查技术的发展，可筛查的疾病种类不断增多，串联质谱技术以及分子生物学技术有效推动了新生儿遗传代谢病筛查的自动化和筛查效率。遗传代谢病对新生儿危害极大，不仅可引起各个系统器官损伤，甚至导致死亡，早期诊断对该病预后意义重大。

串联质谱检测干血滤纸片多种溶酶体酶活性方法的建立

目的建立串联质谱法测定干血滤纸片中半乳糖神经酰胺酶（GALC）、酸性α－葡萄糖苷酶（GAA）、α－半乳糖苷酶（GLA）、α－L－艾杜糖苷酸酶（IDUA）活性。方法 方法学建立。收集2013年7月、11月在上海市新华医院新生儿筛查中心进行遗传代谢性疾病筛查的2 175份干血滤纸片标本和2012年9月至2014年1月在新华医院儿科就诊的20例溶酶体贮积病（lysosomal storage disorders，LSDs）患儿干血滤纸片样本。干血滤纸片提取液与酶底物及内标孵育后，经液液和固相萃取，氮气吹干，复溶后串联质谱分析酶反应产物和内标，计算酶活性。评价方法的线性、精密度、准确度和最低检测限；检测2 175份新生儿－干血滤纸片样本，0.5～99.5百分位数法确立4种酶活性参考区间；同时检测20例LSDs患儿干血滤纸片样本进行临床验证。结果 酶活性测定批内和批间精密度为1.7%～11.8%，批内和批间准确度为85%～115%，产物和内标实测浓度比值与添加的理论浓度比值线性系数为0.997～0.999。GALC、GAA、GLA和IDUA的最低检测限分别为0.03 μmol/（L·h）、0.09 μmol/（L·h），0.12 μmol/（L·h），0.16 μmol/（L·h）；初步确定新生儿酶活性参考区间分别为GALC[0.51～8.51 μmol/（L·h）]，GAA[1.99～22.22 μmol/（L·h）]，GLA[1.68～41.59 μmol/（L·h）]，IDUA [2.36～19.21 μmol/（L·h）]；20例LSDs患儿酶活性明显低于参考区间，串联质谱法能有效检出Krabbe、Pompe、Fabry、MPSⅠ患儿。结论 成功建立了串联质谱法检测干血滤纸片中GALC、GAA、GLA、IDUA活性。

假性缺陷等位基因影响糖原贮积病Ⅱ型的新生儿筛查

目的探讨假性缺陷等位基因携带情况对荧光法检测干血滤纸片酸性葡萄糖苷酶(GAA)活性进行新生儿糖原贮积病n型(G S D n)筛查的影响。方法对2017年5至12月上海交通大学医学院附属新华医院新生儿疾病筛查中心的30507份新生儿干血滤纸片(dried blood spot,DBS)通过荧光法检测其酸性a-葡萄糖苷酶(GAA)活性进行GSDII筛查,对筛查疑似阳性新生儿原DBS经GAA基因分析确认其基因突变及假性缺陷等位基因的携带情况。回顾性分析3172例非GSDII人群和36例GSDII患者中假性缺陷等位基因携带情况,采用卡方检验或Fisher确切概率法对假性缺陷等位基因携带频率进行数据统计分析。结果30507份新生儿DBS标本GAA酶活性呈正偏态分布,初次和二级筛查检出29例新生儿疑似阳性,GAA基因分析未发现GSD I I患者,但该29例中24例携带纯合假性缺陷等位基因c.[1726A/A;2065A/A],5例携带杂合假性缺陷等位基因c.[1726G/A;2065G/A]。3172例非GSD I I人群中假性缺陷等位基因c.1726G>A纯合子频率为2.08%(66/3172),当c.1726 G>A纯合突变时,同时发生c.2065 G>A纯合突变频率为100%(66/66),c.[1726A;2065A]单倍体型频率为3.2%(206/6344)。36例GSD I I患者中6例(16.67%,6/36)携带纯合假性缺陷等位基因c.[1726A/A;2065A/A],显著高于非GSDII人群(2.08%,66/3172)(P<0.001,x2=34.517)。结论假性缺陷等位基因在中国人群中携带率较高,可导致荧光法检测GAA酶活性进行新生儿GSDII筛查的假阳性率升高,新生儿筛查后对原干血滤纸片的基因检测可降低其对新生儿筛查的影响。

不同方法测定PKU随访患者干血滤纸片Phe浓度的比较

目的 比较串联质谱（MS/MS）,包括非衍生标准曲线定量法（简称＂标曲法＂）和衍生法、非衍生法及荧光法在苯丙酮尿症（PKU）随访患者血苯丙氨酸（Phe）浓度测定中的应用.方法 收集上海新华医院随访的204例PKU患者干血滤纸片（DBS）样本;MS/MS标曲法、衍生法、非衍生法及荧光法测定Phe浓度,分为低、中、高,即〈360、360-600和〉600 μmol/L 3组,对Phe检测值进行一致性检验及非参数检验.结果 MS/MS标曲法批内和批间精密度为4.0%-7.2%,回收率为93.2%-97.3%.一致性检验显示各组Phe检测值在95%一致性界限外的值不超过8.1%.低、中浓度组,荧光法、MS/MS标曲法和衍生法Phe检测值四分位数分别为176（118,251）μmol/L、174（94, 273）μmol/L、153（94,242）μmol/L,和540（478,578）μmol/L、485（414,529）μmol/L、466（402,513） μmol/L;荧光法较MS/MS标曲法高4.8%-9.0%,（Z=-3.787--2.674,P〈0.01）;MS/MS非衍生法较标曲法低3.9%-5.2%,（Z=-7.474--5.747,P〈0.01）;高浓度组,MS/MS标曲法、衍生法、非衍生法和荧光法检测值为807（695,924）μmol/L,700（575,785）μmol/L,680（623,771）μmol/L和711（674,794）μmol/L,MS/MS标曲法较其他方法高10.9%-16.2%,（Z=-4.458--4.356,P〈0.01）.结论 MS/MS标曲法测定DBS中Phe浓度特异性和准确度较好,4种方法测定血Phe浓度一致性较好,虽检测值存在差异,但均可用于多数PKU患者的Phe浓度监测.