视网膜干细胞培养上清液诱导骨髓间充质干细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化可为神经系统受损伤后的修复和再生带来了新的希望。目的:探讨骨髓间充质干细胞在视网膜干细胞培养上清液诱导条件下向神经元细胞分化。方法:采用全骨髓培养方法,用视网膜干细胞培养上清液诱导骨髓间充质干细胞,通过免疫荧光染色鉴定其分化的结果。结果与结论:诱导72 h,骨髓间充质干细胞表达神经干细胞的特异性抗体巢蛋白和神经元中的标志性微管相关蛋白微管相关蛋白2。视网膜干细胞培养上清液能够促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,提示视网膜干细胞可能分泌神经生长因子。

体外培养骨髓干细胞及趋化因子受体CXCR4的表达

背景:有实验证明骨髓间充质干细胞表面CXCR4的表达水平决定了细胞向靶组织归巢及随后血管生成的效率。目的:分析骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及多向分化潜能,探讨细胞表面CXCR4的表达在促血管再生作用领域的意义。方法:无菌条件下骨穿针垂直穿刺髂后上棘处抽取猪骨髓,并行分离及培养,得到传代的骨髓间充质干细胞,并行体外细胞凋亡检测,骨髓间充质干细胞表面蛋白CXCR4的检测:并行骨髓间充质干细胞的凋亡周期检测。结果与结论:实验分离骨髓间充质干细胞的细胞形态比较均一。传代培养后,细胞不再以集落方式生长,而呈分布均匀的纺锤形。细胞在4d左右开始快速增长,1周后细胞生长进入稳定期。流式细胞仪检测发现细胞表面CXCR4的表达较多。证明实验成功分离骨髓干细胞,CXCR4蛋白在细胞体外培养中明显高表达,提高CXCR4的表达将为骨髓间充质干细胞移植促进血管再生、治疗下肢缺血性疾病提供临床治疗依据。

快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系

背景:目前常用的成脂刺激剂主要由胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛组成,该体系涉及处理因素多、诱导周期长且对细胞毒性大,不利于脂肪形成抑制效应的研究。目的:建立快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系。方法:大鼠全骨髓细胞原代培养,胰酶消化传代,富集形态均质的间充质干细胞,利用过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂噻唑烷二酮类药物罗格列酮和吡咯列酮体外单独诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化,设立无糖、低糖和高糖DMEM三种基础培养体系,以经典的成脂刺激剂作为阳性对照,在诱导的不同时间点对分化细胞进行形态学观察和油红O染色。结果与结论:与经典成脂刺激剂相比,罗格列酮或吡咯列酮单独均能诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,吡咯列酮诱导48h和罗格列酮诱导72h均可观察到富含脂滴或脂泡以及油红O染色的阳性细胞,吡咯列酮与罗格列酮的最佳诱导浓度分别为0.125mmol/L和10μmol/L,而高糖环境利于大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化。说明基于高糖培养环境的以吡咯列酮或罗格列酮做为成脂刺激剂的培养体系可快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。

人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后心肌特异性肌钙蛋白I的表达

背景:人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,经诱导后是否可向心肌细胞分化?目前的报道尚不多。目的:观察人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后肌钙蛋白I的表达情况。方法:取第2代人脐带间充质干细胞标本,经消化、离心、沉淀后,分为7份,制成细胞悬液,调整细胞浓度为2×107L-1,分别加入浓度为80,40,20,10,5,2.5,0μmol/L5-氮胞苷于同样条件继续培养,作用24h后除去,继续培养4周。结果与结论:①人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷处理24h之后,各组细胞都会出现部分死亡,失去典型的梭形形态,成为棍状或者柱状,40,80μmol/L组细胞形态变化明显。②免疫组化染色显示5,10,20,40,80μmol/L组诱导后2周心肌特异性肌钙蛋白I表达呈阳性,对照组与2.5μmol/L组心肌特异性肌钙蛋白I表达为阴性。选取5个高倍视野进行细胞计数,80,40,20,10μmol/L组间心肌样细胞的转化率差异无显著性意义,均明显高于5μmol/L组(P<0.05)。③超微结构观察显示经5-氮胞苷诱导后4周时部分人脐带间充质干细胞内可见典型的肌小节及心房颗粒。而未经5-氮胞苷诱导的对照组无以上改变。结果提示经5-氮胞苷诱导后人脐带间充质干细胞能够向心肌样细胞转化。

哺乳动物神经干细胞扩增技术研究进展

该文着重介绍近年来人源与鼠源神经干细胞扩增的进展,包括其体外生长的最适环境,无血清培养基与生物反应器研究。最后,对神经干细胞的扩增与应用做出展望,并对大规模培养中存在的问题进行了探讨,提出了一些新的见解。

干细胞治疗阿尔茨海默病的研究进展及挑战

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是中枢神经系统常见的慢性进行性神经退行性疾病,病理特征主要是细胞外淀粉样蛋白沉积,细胞内神经元纤维缠结以及神经元丢失等,其中神经元丢失是造成AD患者功能损伤的根本原因之一。目前对AD的治疗多以缓解症状为主,而不能从根本上解决AD的病理特征。近年来,神经再生理论的发展和干细胞体外培养的成功为AD的治疗提供了一个崭新的视野。目前,干细胞来源主要包括神经干细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、诱导性多功能干细胞等。干细胞主要通过修复和替代受损神经细胞、重建细胞环路和功能、神经保护和营养支持、抑制淀粉样蛋白的形成和调解免疫功能等发挥治疗AD的作用。该综述主要介绍外源性移植干细胞治疗AD的研究进展及挑战,以及小分子化合物促进内源性神经再生的研究现状。

两份人脐血间充质干细胞混合培养及向神经元样细胞的分化

背景：脐血间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞，但在临床中发现干细胞培养细胞增殖的数量不足。目的：观察两份脐血间充质干细胞混合培养的生长情况，以及经碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化。设计、时间及地点：于2007—01/10在郑州大学基础医学院微生物与免疫学实验室完成以细胞为对象的对照观察性实验。材料：健康分娩产妇自愿捐献的脐血60～180mL。方法：应用Ficoll—Hypaque淋巴细胞分离液以密度梯度法获取脐血间充质干细胞，加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化。当细胞传至第3代时，随机取培养的6份脐血间充质干细胞（半量）为A组，6份脐血间充质干细胞（半量）为B组，将A、B组各剩余的半量脐血间充质干细胞混合为C组。3组细胞密度均为1．0×10^4L^-1。主要观察指标：以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量，免疫组织化学检测脐血间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。结果：活细胞计数和MTT比色检测显示，将两份不同脐血间充质干细胞混合后，细胞贴壁比单份脐血间充质干细胞快（P〈0．05），增殖也非常快（P〈0．05）。3组细胞经碱性成纤维细胞生长因子诱导后均表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白，并且巢蛋白阳性表达率无差别（P〉0．05）。结论：混合脐血间充质干细胞之间有互相促增殖作用，应用碱性成纤维细胞生长因子诱导的脐血间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白。

小细胞肺癌干细胞和肿瘤组织中HIF-1α和HIF-2α的表达及意义

目的观察小细胞肺癌干细胞和肿瘤组织中HIF-1α和HIF-2α的表达,并探讨其临床意义。方法采用干细胞无血清培养技术富集小细胞肺癌细胞系H446第3代肿瘤球细胞作为肿瘤干细胞;实时荧光定量PCR法检测H446干细胞中HIF-1α和HIF-2αmRNA的表达;免疫荧光法检测H446干细胞中HIF-1α和HIF-2α蛋白表达;免疫组化SP法检测小细胞肺癌组织中HIF-1α和HIF-2α蛋白表达。结果小细胞肺癌干细胞HIF-2αmRNA表达上调(P<0.05),而HIF-1αmRNA表达下调(P<0.05);小细胞肺癌干细胞中HIF-2α蛋白呈阳性,而HIF-1α蛋白呈阴性;小细胞肺癌组织中HIF-1α的阳性率为46.7%(28/60),HIF-2α阳性率为25%(15/60)。相关分析结果显示HIF-2α与小细胞肺癌干细胞标志物u PAR呈正相关且两者共同表达于小细胞肺癌坏死组织周围区域;HIF-2α与小细胞肺癌肿瘤直径和远处转移有关(P<0.05),而HIF-1α与患者年龄、性别、肿瘤直径、淋巴结转移、胸膜侵袭和远处转移无关(P>0.05)。结论 HIF-2α在小细胞肺癌干细胞中表达上调且与小细胞肺癌干细胞标志物u PAR呈正相关,与小细胞肺癌肿瘤直径和远处转移相关,提示HIF-2α表达可能与小细胞肺癌干细胞样特征有关。

逆行撕除法联合MMC及自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉

目的:观察逆行撕除法联合丝裂霉素C(MMC)及自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床疗效。方法:对89例89眼行逆行撕除法治疗翼状胬肉,同时使用MMC局部浸敷及自体角膜缘干细胞移植,观察手术后角膜创面修复时间及术后复发率。术后随访1～12(平均5)mo。结果:所有患者的角膜创面在术后3～7(平均5)d恢复,移植片生长良好,5例复发,复发率为6%。结论:逆行撕除法联合MMC及自体角膜缘干细胞移植可有效治疗翼状胬肉,降低术后复发率。

改良自体角膜缘干细胞结膜瓣移植治疗翼状胬肉的美容效果

目的：探讨改良自体角膜缘干细胞结膜瓣移植治疗翼状胬肉的美容效果。方法：95例（100眼）原发性翼状胬肉患者采用逆行撕除联合自体角膜缘干细胞结膜瓣移植的方法,术后随访6~24个月观察治疗效果。结果：89眼与正常眼外观无差异,结膜无充血增厚,手术创面平整光滑。11眼出现结膜轻度充血及结膜瘢痕形成,未见胬肉复发。结论：手术切除联合自体角膜缘干细胞结膜瓣移植治疗翼状胬肉复发率低,美容效果好。

全反式维甲酸及银杏提取物对神经干细胞分化的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)、银杏提取物(Egb)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化为胆碱能神经元和多巴胺能神经元的作用。方法取第3代NSCs诱导分化,试验分为4组:ATRA组(10-8mol/L)、Egb组(2mg/L)、ATRA(10-8mol/L)+Egb组(2mg/L)和空白对照组;免疫细胞化学染色检测神经微管相关蛋白(MAP2)、乙胆碱酯酶(AchE)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达,并计算阳性染色细胞的百分率。结果ATRA组诱导神经干细胞分化为AchE阳性和TH阳性神经元的百分率分别为26·32%±3·62%和12·02%±2·78%;Egb组分别为42·93%±3·08%和18·13%±1·74%;ATRA+Egb组分别为43·32%±5·60%和13·03%±2·54%;空白对照组分别为27·68%±2·51%和5·74%±1·81%。结论ATRA和Egb均可促进NSCs向TH阳性神经元分化,Egb还可促进NSCs向AchE阳性神经元分化,ATRA和Egb联用无协同效应。

骨髓间充质干细胞成骨性能的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞的生物学特性以及作为组织工程骨种子细胞的特点。方法分离培养兔骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养,建立兔桡骨节段性缺损模型,分为空白组(n=8,不植入材料)、对照组(n=8,植入材料)、实验组(n=8,植入复合细胞的材料)。通过大体观察、组织学分析及X线摄片了解成骨情况。结果兔骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,复合细胞的材料植入16周后,X线摄片可见桡骨缺损处连接良好。结论骨髓间充质干细胞具有很强的成骨作用,是一种较好的组织工程种子细胞。

神经营养因子3促进骨髓间充质干细胞向类神经元分化的信号通路

骨髓间充质干细胞在适当环境中，可被诱导分化为神经元，及神经胶质细胞，被认为是最好的种子细胞。神经营养因子3为一种多功能的神经营养因子，对神经系统的发育及维持其正常生理功能具有重要意义。文章旨在探讨神经营养因子3促进骨髓问充质干细胞向类神经细胞分化的作用及可能的信号传导通路。

神经干细胞分化过程中NgR表达的变化

目的检测大鼠脊髓来源神经干细胞分化过程中NgR的表达情况。方法悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞,检测神经球及其分化后不同时间点、不同细胞亚型的NgR表达情况。结果神经干细胞分化前和分化第1天所有细胞都显著表达NgR,NgR表达阳性率在分化第2天降至82.1%±4.14%,分化第3天降至最低点35.3%±4.31%。分化后形成的细胞中只有神经元和少量未分化细胞表达NgR,星形胶质细胞和少突胶质细胞不表达NgR。结论在神经干细胞分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞的过程中NgR基因表达被关闭,而在其分化成神经元的过程中则始终表达NgR。

前列腺癌干细胞研究进展

前列腺癌是男性患者中最常见的癌症,严重危害男性的健康。目前关于前列腺癌的发病理论并不能完全解释该疾病异质性、转移性生长、耐药性和肿瘤复发的机制。前列腺干细胞是前列腺中具有自我再生和增殖功能的异质亚群,能产生构成前列腺上皮的所有细胞谱系。根据癌症干细胞假说,前列腺癌可能是一种干细胞疾病。前列腺癌干细胞具有明显的克隆形成性和治疗抵抗性,并在前列腺恶性肿瘤的发生和发展中起决定性作用,选择性靶向这些干细胞的治疗策略已引起了广泛的关注。本文主要论述前列腺癌干细胞的起源、鉴定、分子标记及临床应用,揭示癌症干细胞的生理功能,并获得有关其可能参与前列腺癌发病机理的基本知识,为将来开发有效的治疗策略提供理论基础。

自体角膜缘干细胞移植联合曲安奈德治疗复发性翼状胬肉的疗效

翼状胬肉术后复发的主要因素是自体角膜缘干细胞移植治疗后角膜缘干细胞短缺。本文对我院收治的47例50眼翼状胬肉患者行自体角膜缘干细胞移植联合曲安奈德治疗,术后随访,未发现患者有复发迹象。可见行复发性翼状胬肉切除后,使用自体角膜缘干细胞移植进行治疗,术后局部应用曲安奈德,疗效显著,值得临床推广。

机采自体外周血干细胞移植治疗Ⅳ期压疮1例

背景：目前应用自体外周血干细胞治疗糖尿病足、血管闭塞性脉管炎等难愈合创面，而压疮是慢性创面的典型代表。机采外周血干细胞移植与骨髓移植比较具有操作简便、不需麻醉、失血量少、造血重建比骨髓移植快、植入率高、免疫功能重建早且短期内可重复分离等优点。目的：观察机采自体外周血干细胞移植治疗Ⅳ期压疮的效果。方法：杭州市老年病医院慢创诊治中心收治的1例女性40岁10cm骶尾部Ⅳ期压疮合并感染患者，经机单采自体造血干细胞50mL，以创口中心按2cm×2cm间距注射点向四周覆盖全部创面。结果与结论：干细胞植入1周后创面组织形态明显改善，未出现明显不良反应。提示机采自体外周血干细胞移植能有效治疗Ⅳ期压疮。

Shox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化

目的探讨矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2,Shox2)外源基因对犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,c MSCs)体外诱导分化的影响。方法分离培养犬骨髓间充质干细胞,用包装好的两种慢病毒载体p Lentis-m Shox2-RFP及p Lentis-RFP分别转染第3代c MSCs,收集转染阳性的c MSCs与乳鼠心肌细胞(rat ventricular myocytes,NRVMs)共培养。实验分4组:A组(RFP-c MSCs组)、B组(RFP-c MSCs+NRVMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-c MSCs组)、D组(Shox2-RFPc MSCs+NRVMs共培养组)。共培养诱导分化5 d后,利用嘌呤霉素对c MSCs进行纯化,运用全细胞膜片钳检测诱导出内向电流的动力学特征,运用实时荧光定量PCR、Western blot检测HCN4、Tbx3、Cx45/43、Nkx2.5等标志性基因mRNA和蛋白的表达情况,并行免疫荧光检测。结果 Western blot及RTPCR检测结果显示,D组细胞Shox2、HCN4、Tbx3、Cx45窦房结细胞特异性基因的表达较A、B、C组明显增高(P<0.05),B组细胞Cx43及Nkx2.5较C、D组细胞明显增高(P<0.05);免疫荧光结果显示,在Shox2基因调控作用下,c MSCs有HCN4通道生成;膜片钳检测结果显示,C、D组细胞产生了具有明显时间-电压依赖性的内向电流,且对细胞外Cs+敏感,符合起搏离子流If的动力学特征;而A、B组未检测出此电流。结论经m Shox2基因修饰的c MSCs通过体外诱导,产生了起搏离子流If并高表达窦房结标志性基因,成功向具有一定自主搏动能力的窦房结样细胞分化。