建立非基因整合原发性骨髓纤维化诱导性多能干细胞株

目的:利用诱导多能性干细胞(iPSC)技术建立原发性骨髓纤维化(PMF)诱导多能性干细胞系,为研究血液病的发生发展提供一个实验模型。方法:采用非基因整合型质粒重编程携带JAK2V617F突变的PMF患者骨髓来源的单个核细胞,诱导生成该患者特异的iPS细胞株。结果:采用此方法建立的iPS细胞株,在体外能够稳定传代,无外源性基因整合,多能性基因表达水平与人胚胎干细胞类似,在体内具有形成三胚层结构的能力。测序结果显示,所建立的患者的iPS细胞株携带不同负荷的JAK2V617F突变。结论:成功地建立非基因整合的PMF患者特异的iPS细胞株,这为研究PMF的发病机制、化疗药物筛选及实现精准化治疗提供了一个重要的疾病模型。

诱导多能性干细胞的获取及其在口腔组织再生中的作用及应用

背景:干细胞是再生医学的基础,诱导多能性干细胞的出现开启了干细胞研究的新篇章,被认为是近10年干细胞研究的重大突破。将成人体细胞重新编程为多能干细胞解决了伦理学和免疫排斥等矛盾,实现了个性化的基于细胞的疗法,革新了疾病的研究方式和治疗策略。近年来的研究发现诱导多能干细胞在口腔再生医学领域也具有极大的应用价值,虽然此研究还处于初级阶段,但诱导多能性干细胞在牙齿组织再生中已表现出巨大的潜力。目的:对诱导多能性干细胞的来源、诱导条件及其在口腔组织医学中的应用和研究等方面作一综述。方法:由第一作者以"诱导多能干细胞、口腔组织再生、成人体细胞";"iPSCs,dental tissue regeneration,adult somatic cells"为关键词,检索从2010年至2018年PubMed,Medline,中国知网,万方等数据库上与诱导多能性干细胞和口腔组织工程医学相关的文献,语言设为中文和英文,排除与文章研究要求无关及重复性的文章,纳入符合标准的62篇文献进行综述。结果与结论:诱导多能性干细胞的研究开启了干细胞研究的新方向,它来源广泛,但从口腔组织获取有其独特的优势。此外,诱导多能性干细胞避免了阻碍胚胎干细胞发展的免疫干扰和伦理问题。现有的文献已证实诱导多能干细胞能分化成牙体组织,牙周软组织及牙槽骨组织,在口腔组织再生应用方面有广阔的应用前景。

拷问诱导多能性干细胞的应用前景

诱导多能性干细胞（iPS细胞）是指通过特定基因的表达将完全分化的成年细胞重新编程为类似胚胎状态的全能性或多能性的细胞。2006年,日本的Yamanaka研究小组首次报道利用逆转录病毒将4种转录因子组合导入已分化的小鼠纤维母细胞中,获得iPS细胞。由于iPS细胞绕开了胚胎干细胞（ES）研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍而受到科学家们的青睐,引发了研究热潮。2007年Science、Nature和Times等杂志均以iPS细胞逆转＂生命时钟＂为名将其评选为年度十大科学突破。

羊水中多能性干细胞的培养及分化

羊水中存在多能性干细胞,它们不仅阳性表达胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)表面标志物,如SSEA-4,保持未分化状态的转录因子OCT-4,胚胎多能性维持因子Nanog等;而且阳性表达成人干细胞(adult stem cell,ASC)表面标志物CD29和CD44等,在特定的诱导条件下能够分化为代表三胚层生殖层系。

诱导多能性干细胞在心脏疾病领域的研究和应用

诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）是一种类似于胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）的、具有自主增殖和分化能力的多能性干细胞。iPSCs可以由各种不同动物的不同体细胞重编程转化而来,能增殖并分化成各种体细胞,其中包括具有收缩和兴奋功能的心肌细胞。截止目前,iPSCs分化的心肌细胞主要用于以下几个方面：

雄性多能性生殖干细胞及其应用于制作转基因动物的潜能

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性动物体内唯一可以将遗传信息遗传给后代的成体干细胞,具有自我更新和分化为精子的能力。对于小鼠而言,随着精原干细胞体外培养体系的逐渐建立和完善,人们不仅对精原干细胞自身的增殖和分化调节机制有了较深入的了解,同时也发现了精原干细胞在再生医学和转基因动物领域具有其独有的优越性,目前的研究结果已经可以通过安全的途径将小鼠精原干细胞诱导转变为和胚胎干细胞功能相似的多能性干细胞,同时也实现了通过异体移植精原干细胞的方式来制作转基因小鼠和大鼠。这些研究结果让人们看到了精原干细胞对人类再生医学和制作大型转基因动物具有巨大的应用潜力。本文将对通过诱导精原干细胞获得的多能性干细胞的研究现状及其用于制作大型转基因动物所面临的问题和可能的解决途径加以概述和总结。

无血清单层细胞诱导法培养猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞

背景:诱导多能性干细胞是一种新型的干细胞来源,具有多向分化潜能。猪作为人类心血管及代谢性疾病研究的良好模型,对其多能性细胞向血管内皮细胞定向分化体系的建立,将为创建心血管疾病模型提供保障。目的:建立一种无血清单层诱导分化方法,使猪诱导多能性干细胞定向分化为CD31阳性血管内皮细胞,并对获得的内皮细胞进行鉴定。方法:使用CHIR99021、骨形态发生蛋白4、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子等对猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞进行单层细胞诱导分化,使干细胞经历3个分化阶段最终成为血管内皮细胞,检测并比较分化过程中2种干细胞的胚层标记基因的表达,对流式分选后获得的血管内皮细胞进行鉴定。结果与结论:①通过无血清单层细胞诱导法从猪诱导多能性干细胞定向诱导分化获得的内皮细胞具有与猪永生化主动脉血管内皮细胞类似的基因表达模式及生物学功能——能够吸收低密度脂蛋白并在Matrigel上形成微血管样结构;②该诱导体系下,猪诱导多能性干细胞的分化效率高于人胚胎干细胞的分化效率,这可能与诱导过程中2种细胞谱系基因表达模式上的差异相关。

获得多能性干细胞的方法

胚胎干细胞系的获得为细胞和器官损伤及病变的治疗提供了新的途径,但是治疗用细胞和受体病人之间免疫不相容问题妨碍了干细胞临床应用.近年来对分化细胞重编程研究使研究人员可以获得多能性干细胞,这为解决这一难题带来了新的希望.对获得多能性干细胞所涉及的机制以及方法进行了综述.

转基因小鼠支持细胞体外重编程为诱导多能性干细胞的研究

试验旨在研究利用4种特定转录因子将转基因小鼠支持细胞体外重编程为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。通过逆转录病毒载体将4种特定转录因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4导入转基因小鼠支持细胞,同时以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)空载体检测病毒感染情况。感染的支持细胞3d左右表达GFP蛋白,同时细胞开始缩小聚集,失去原有支持细胞形态,逐步形成突起样克隆,16d左右感染的支持细胞不表达GFP蛋白,形成具有典型干细胞特征的iPS细胞。碱性磷酸酶染色表明iPS细胞处于未分化状态;反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测iPS细胞可表达胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)特异性基因;体外悬滴培养可形成拟胚体(embryoid body,EBs),可分化为三胚层来源的多种细胞。

非基因整合建立人诱导多能性干细胞方法的优化研究

诱导多能性干细胞(iPSC)技术具有临床应用前景,但iPSC的遗传稳定性和成瘤性阻碍了其可能的临床应用。非整合质粒(Episomal)方法无外源基因整合到宿主基因组上并且方法简单,适宜推广,是目前保证iPSC遗传安全性的最佳方案之一,但其诱导效率偏低,严重阻碍了其应用。本研究旨在优化Episomal方法,将脐血单个核细胞(CB MNC)重编程为诱导多能性干细胞(iPSC),建立无基因整合的iPSC的高效生成技术体系,为以后建立疾病iPSC奠定基础。利用CB MNC,通过比较不同氧含量,诱导质粒,MNC培养方法和预刺激时间等条件对Episomal方法进行优化。结果表明:CB MNC采用红系培养液,培养8 d,使用启动子为SFFV(spleen focus forming virus)的Episomal载体,在低氧(3%)条件下诱导,CB MNC重编程效率最高,可达到0.12%。通过分析最佳条件下供体细胞成分发现,表型为CD36+CD71+CD235alow的有核红细胞是重编程最主要的供体细胞来源。结论:本研究成功建立并优化出一种可推广的高效安全的,可以用于临床应用研究的iPSC诱导技术。

人尿源性诱导多能干细胞在遗传病治疗中的应用前景

遗传病传统的临床治疗方法只能减轻或矫正患者的临床症状,不能改变患者携带的致病基因。揭示遗传病的发病机制,利用基因治疗改变细胞中的遗传物质是根治遗传病的有效途径。干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能特性的细胞,其中人尿源性诱导多能干细胞具有容易获得、易于培养增殖、重编程率高等优点,且可被诱导分化为多种细胞和器官。该文总结了近五年来人尿源性诱导多能干细胞的高效重编程方法,并整理其在心脏、肌营养不良、脊髓型肌萎缩等相关遗传病的疾病模型复制、机制探索及可行性治疗方面的应用,为遗传病的临床治疗研究提供更多的思路。

Rheb1在小鼠巨核-红系多能性干细胞发育中的作用

目的:研究Rheb1基因在小鼠巨核-红系多能性干细胞发育成熟中的作用及相关的机制。方法:利用Vav-Cre在造血系统中特异性敲除小鼠Rheb1(Vav1-Cre;Rheb1^(fl/fl),Rheb1^(Δ/Δ)小鼠),采用流式细胞术检测Rheb1敲除组和对照组小鼠骨髓和外周血中红系细胞的比例;CFC克隆形成实验检测敲除组和对照组小鼠骨髓中巨核-红系多能性干细胞体外克隆形成能力;利用实时荧光定量PCR检测敲除组和对照组小鼠巨核-红系多能性干细胞中PU.1、GATA-1、GATA-2、CEBPα和CEBPβ的相对表达量;在培养基中加入雷帕霉素,检测野生型小鼠巨核-红系多能性干细胞体外克隆形成能力的变化。结果:Rheb1敲除后,小鼠骨髓中红系细胞发育受抑且应激能力减弱,小鼠骨髓中巨核-红系多能性干细胞体外克隆形成能力减弱,GATA-1的表达水平降低;雷帕霉素可以抑制野生型小鼠骨髓中巨核-红系多能性干细胞体外克隆的形成。结论:Rheb1基因在小鼠巨核-红系多能性干细胞发育中具有重要的调控作用,Rheb1可能通过mTOR信号通路调控小鼠巨核-红系多能性干细胞发育。

诱导性多能干细胞研究进展及其在再生医学中的应用

Yamanaka在2006年首次报道了体外诱导体细胞成为具备类似胚胎干细胞（embryo stem cell，ES）功能的多能性干细胞，开创了干细胞研究的新篇章，许多研究小组竟相开展这方面研究。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem，iPS）是利用特定转录因子转入体外培养的体细胞中，直接诱导其成为具有多种分化潜能的干细胞。

诱导多能性干细胞与心肌细胞的融合细胞遗传表型特征研究

目的体外构建诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)与心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的融合细胞,探讨其细胞遗传学以及定向分化等生物学特点。方法 i PSCs与原代心肌细胞通过聚乙二醇(PEG-4000)诱导融合,检测融合细胞染色体数分布情况,融合细胞碱性磷酸酶染色,鉴定亲本细胞特异性基因和蛋白在融合细胞中的表达情况,以及当融合细胞失去亲本心肌细胞表型时,其向心肌细胞分化的能力。结果融合细胞表现为i PSCs样的特点;融合细胞主要表现为四倍体或者近似四倍体的核型(超过75%的融合细胞染色体数目在76~80条之间);碱性磷酸酶的阳性率低于同时间点的i PSCs;干细胞特异性基因Oct-4和Nanog的表达量在融合细胞与i PSCs中没有差异,而心肌细胞特异性基因α-MHC和β-MHC在融合细胞中的表达量明显低于心肌细胞;Oct-4蛋白在不同代数的融合细胞中均有表达,而随着时间的延长,c Tn T蛋白逐渐呈阴性表达;失去亲本心肌细胞表型的融合细胞能够向心肌细胞分化,且分化率高于同时间点的i PSCs。结论 i PSCs与原代心肌细胞的融合细胞,初期表现出双向重建,P5代后完全表现出干细胞显型,并且能向心肌细胞分化。

诱导性多能干细胞与心血管疾病

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)可通过对多种终末分化的体细胞进行外源性重编程而获得。iPSCs作为自体来源的细胞,在组织修复领域有着巨大的应用前景。然而,iPS诱导技术尚存在诸如制备率低、成瘤风险增加和整合基因残留等一系列问题。现结合国内外最新研究成果,在介绍有关解决iPSCs自身缺陷上所取得的研究进展的同时,重点对iPSCs的心肌定向诱导分化、iPS细胞源性心肌细胞的细胞特性以及其在心血管疾病再生医学临床治疗的最新研究进展做一综述。

P53通过促进miR-145的表达抑制肺腺癌A549细胞的干细胞特性

目的:探讨P53抑制肺腺癌A549细胞干细胞特性及其机制。方法:收集2014年3月至2015年12月解放军第85医院胸外科手术切除的30例非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)患者癌组织及癌旁组织,采用Real-time PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中miR-145的表达。构建人P53基因的真核表达载体(pcDNA3.1-P53)和突变载体[pcDNA3.1-P53R273H(CGT-CAT)],设计靶向P53基因的siRNA,分别转染A549细胞;细胞分为对照转染组(Vector或NCsiRNA)和实验组(Flag-P53或P53-siRNA);Western blotting检测P53蛋白过表达和干扰效率,Real-time PCR检测OCT4和miR-145的表达,荧光双报告基因和Western blotting技术检测证实A549细胞中干细胞多能性调节基因(OCT4)为miR-145的靶标分子。结果:NSCLC组织中miR-145的表达水平明显低于癌旁组织[(2.31±0.13)vs(3.51±0.27),P<0.01];P53明显促进A549细胞中miR-145的表达[(1.84±0.14)vs(1.00±0.00),P<0.01];miR-145 mimics显著抑制A549细胞中pGL3-OCT4-3′-UTR活性(P<0.01)和OCT4蛋白表达水平(P<0.05),而转染miR-145抑制剂可进一步增加OCT4表达水平,且逆转P53对A549细胞的干细胞特性的抑制作用。结论:P53通过促进miR-145表达下调OCT4表达,进而明显抑制A549细胞的干细胞特性,该结果为肺腺癌的临床诊断和治疗提供了新途径。

位于毛囊脊的多能性成体干细胞与DNA的损伤修复

稳定和精确的基因信息是生物体在阻止肿瘤形成和延缓衰老的过程确保细胞自身功能的关键。由于外环境的作用会导致DNA损伤,进而修改基因信息,使突变与不同的疾病相联系。成体干细胞位于组织内且自我更新时间长,因此容易累积有害突变，至今对成体干细胞如何感知DNA损伤并作何种反应仍不了解。

利用人多能性干细胞产生能够自我更新的内皮层祖细胞

据Cheng X 2012年4月6日[Cell Stem Cell,2012,10（4）：371-384]报道,内胚层祖细胞（endodermal progenitor cell,EPCs）在体外培养时或者移植到动物时,能够分化为多种细胞类型,其中代表性的细胞是在肝脏、胰腺和肠道中发现的那些细胞。

利用诱导性多能干细胞改善盲鼠的视力

据2012年10月9日Li Y（Mol Med,2012 Agu 9.doi.110.2119/molmed.2012.00242）报道,一种特殊的多能性干细胞可能能够恢复视力或者阻止视力丧失。在年龄相关性黄斑变性中,因视网膜中的细胞退化而导致中央视力丧失。