人胚生殖嵴干细胞多能性调节基因Oct4的克隆及其在大肠杆菌中的表达(英文)

目的 :克隆人胚生殖系细胞多能性调节基因Oct4 ,并使其在大肠杆菌中表达。 方法 :取 4～ 6周人胚胎分离生殖嵴和背侧肠系膜 ,利用RT PCR技术扩增编码Oct4的全长cDNA ,并插入到原核表达载体 pGEX5T中 ,构建成 pGEX5T Oct4重组质粒。β硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导使该基因在k80 2菌中表达。 结果 :用PCR方法扩增获得大小约 1 .1kb条带 ;全自动测序与GenBank中登录的序列 97%同源。获得了pGEX5T Oct4重组子并在k80 2菌中获得了表达 ,SDS PAGE分析有一特异性的 6 2 0 0 0条带。 结论 :扩增和克隆了人胚生殖系细胞多能性调节蛋白Oct4全长cDNA并在大肠杆菌中获得表达 。

Pladienolide B对牛胚胎干细胞多能性相关基因表达及细胞活力的影响

【背景】牛胚胎干细胞(bovine embryonic stem cells,BESCs)因具备较高的多能性,在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而,BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏,很多机制仍不清楚。【目的】探究不同浓度Pladienolide B(PlaB)对BESCs多能标记基因、全能标记基因、胚胎细胞谱系基因表达及细胞活力的影响,为提高BESCs多能性提供参考和理论依据。【方法】利用免疫荧光检测牛BESCs多能标记基因的表达,利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测不同浓度PlaB对BESCs剪接体、全能标记基因及胚胎细胞谱系基因表达的影响,利用RT-qPCR和Western Blot分别检测不同浓度PlaB对BESCs多能标记基因mRNA和蛋白表达的影响,利用CCK8和EDU染色检测不同浓度PlaB对BESCs增殖的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时显著下调EPSCM-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达水平;PlaB浓度为1.5nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达下降;PlaB浓度范围为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的SF3B4和SF3B5的mRNA表达水平呈剂量依赖性增加。此外,PlaB显著下调CTFR-BESCs中SF3B6的mRNA表达。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接体LSM4的mRNA表达显著下调。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)时,显著下调CTFR-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平;PlaB浓度为1—1.5 nmol·L^(-1)时能显著下调BEPSCM-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平。浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB均以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因OCT4、SOX2及NANOG的mRNA表达水平和蛋白水平。在PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L^(-1)范围内,PlaB以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能标记基因MDM2、PID1及BTG2的mRNA表达水平,而下调DDIT4和PDRG1的mRNA表达水平。CTFR-BESCs中添加PlaB均上调胚胎细胞谱系基因的表达,而EPSCM-BESCs中添加PlaB显著降低GATA4、GATA6、SOX7等胚胎细胞谱系基因的表达,但是对于ZIC1没有显著影响。随着PlaB剂量增加和处理时间延长,CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs细胞活力均呈下降趋势,但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。【结论】PlaB显著上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因和部分全能标记基因的表达;降低EPSCM-BESCs中胚胎细胞谱系基因的表达和细胞活力。PlaB对两种BESCs发挥作用的浓度及对基因表达的影响并不完全一致。由于PlaB降低BESCs的细胞活力,仍需要进一步研究以优化培养体系。

荣昌猪Nanog基因克隆与多能性鉴定

【目的】Nanog基因是一种参与调控与维持干细胞多能性的转录因子,Nanog异位表达可以使体细胞重编程并获得一定的多能性。克隆荣昌猪Nanog基因,构建pMX逆转录病毒载体并鉴定表达载体的转染效率,为荣昌猪进一步的遗传改良与干细胞研究奠定基础。【方法】以荣昌猪生殖嵴为材料,提取总RNA并反转录为cDNA,经PCR扩增克隆得到荣昌猪Nanog基因。采集荣昌猪耳部组织用组织块法培养荣昌猪成纤维细胞,选择第3~5代的猪成纤维细胞作为转染细胞,通过T-A克隆构建pMD18T-Nanog载体;采用T4连接法将Nanog基因连接到pMX逆转录病毒载体上,酶切鉴定后构建pMX-Nanog-neo表达载体,然后将报告基因EGFP连接到pMX-Nanog-neo构建pMX-Nanog-EGFP表达载体。采用脂质体LTX法进行转染,将pMX-Nanog与pCMV-VSVG按照2∶1的比例混合后,将pMX-Nanog-EGFP表达载体转染293GP包装细胞并收集病毒上清液备用,利用Hoechst染核与Nanog抗体免疫组化鉴定其转染表达效果,随后采用相同方法将pMX-Nanog-neo表达载体转染荣昌猪成纤维细胞并扩大培养,同时通过G418筛选阳性细胞株。【结果】成功克隆出荣昌猪Nanog基因,并成功构建pMX-Nanog-neo与pMX-Nanog-EGFP逆转录表达载体。pMX-Nanog-EGFP表达载体转染293GP细胞,48 h后可见稳定表达的EGFP荧光,细胞扩大培养后通过Hoechst染核与Nanog抗体免疫组化鉴定确认了Nanog基因为稳定核表达蛋白,从而确定所构建的逆转录表达载体可以高效转染细胞并稳定表达目的基因。pMX-Nanog-neo载体转染猪成纤维细胞,通过G418(600 ng/mL)筛选获得稳定表达Nanog基因的阳性细胞株。【结论】构建的pMX逆转录病毒表达载体可以将目的基因Nanog稳定转染猪成纤维细胞并高效表达,为今后进一步研究荣昌猪干细胞多能性维持机制、自我更新机制、分化机制及重编程机制提供可靠的技术方法。

雄性多能性生殖干细胞及其应用于制作转基因动物的潜能

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性动物体内唯一可以将遗传信息遗传给后代的成体干细胞,具有自我更新和分化为精子的能力。对于小鼠而言,随着精原干细胞体外培养体系的逐渐建立和完善,人们不仅对精原干细胞自身的增殖和分化调节机制有了较深入的了解,同时也发现了精原干细胞在再生医学和转基因动物领域具有其独有的优越性,目前的研究结果已经可以通过安全的途径将小鼠精原干细胞诱导转变为和胚胎干细胞功能相似的多能性干细胞,同时也实现了通过异体移植精原干细胞的方式来制作转基因小鼠和大鼠。这些研究结果让人们看到了精原干细胞对人类再生医学和制作大型转基因动物具有巨大的应用潜力。本文将对通过诱导精原干细胞获得的多能性干细胞的研究现状及其用于制作大型转基因动物所面临的问题和可能的解决途径加以概述和总结。

转基因小鼠支持细胞体外重编程为诱导多能性干细胞的研究

试验旨在研究利用4种特定转录因子将转基因小鼠支持细胞体外重编程为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。通过逆转录病毒载体将4种特定转录因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4导入转基因小鼠支持细胞,同时以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)空载体检测病毒感染情况。感染的支持细胞3d左右表达GFP蛋白,同时细胞开始缩小聚集,失去原有支持细胞形态,逐步形成突起样克隆,16d左右感染的支持细胞不表达GFP蛋白,形成具有典型干细胞特征的iPS细胞。碱性磷酸酶染色表明iPS细胞处于未分化状态;反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测iPS细胞可表达胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)特异性基因;体外悬滴培养可形成拟胚体(embryoid body,EBs),可分化为三胚层来源的多种细胞。

SPK1基因转染脂肪间充质干细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的治疗效果及对辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响

目的考察SPK1基因转染脂肪间充质干细胞(ADMSC)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果及对辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)平衡的影响。方法采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55对小鼠进行EAE诱导,将44只小鼠随机分为4组:空白对照组(NC组)、模型组(EAE组)、ADMSC组和ADMSC-鞘氨醇激酶1(SPK1)组。在免疫后40 d时,对小鼠进行脑与脊髓的病理学观察、脑组织Th17/Treg相关炎症指标检测、脑和脊髓组织中白细胞介素17和叉头框蛋白P3蛋白表达检测以及脾脏免疫细胞的流式细胞术分析。结果免疫后40 d时,EAE组小鼠脑和脊髓组织发生严重炎性细胞浸润髓鞘脱失严重,ADMSC组与ADMSC-SPK1组脱髓鞘和轴突损伤得到改善;与EAE组比较,ADMSC组和ADMSC-SPK1组的脑组织IL-17A(Z=1.021,P=0.017;Z=1.193,P=0.009)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(Z=2.540,P=0.004;Z=3.005,P=0.006),与ADMSC组比较,ADMSC-SPK1组的脑组织IL-17A与TNF-α水平显著降低(Z=1.223,P=0.011;Z=2.364,P=0.010);小鼠脑和脊髓组织中IL-17A在ADMSC组的表达水平显著降低(t=10.323,P=0.013;t=7.422,P=0.008),且ADMSC-SPK1组显著低于ADMSC组(t=14.244,P=0.017;t=16.865,P=0.006);Foxp3在ADMSC组的表达水平显著升高(t=14.544,P=0.008;t=9.420,P=0.002),且ADMSC-SPK1组显著高于ADMSC组(t=9.654,P=0.005;t=11.535,P=0.009);ADMSC-SPK1组小鼠脾脏中的IL-17+IFN-γ+T细胞比例降低,CD25+Foxp3+Treg细胞比例升高。结论SPK1转染ADMSC对EAE小鼠具有理想的治疗效果,且该效果优于未经SPK1转染的ADMSC,其机制可能与ADMSC-SPK1能显著降低EAE小鼠Th17/Treg细胞比率并减少相关炎症细胞因子的释放有关。

JNK信号通路对犬骨髓间充质干细胞多能性基因表达的影响

旨在探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路对犬骨髓间充质干细胞(cBMSCs)多能性基因的影响。采用密度梯度分选法提取cBMSCs,培养至第3代应用流式细胞术鉴定细胞表面标记物后,将其分为对照组、添加JNK信号通路抑制剂SP 600125的抑制组培养。采用MTT法检测细胞活性,荧光定量PCR检测JNK信号通路相关基因Ras相关的C3肉瘤毒素底物1(RAC 1)、激活转录因子2(ATF 2)和多能性相关基因多梳蛋白4(CBX 4)、性别决定基因相关转录因子2(Sox 2)的mRNA转录水平。流式细胞术检测培养细胞的结果显示,CD34、CD11a、CD45为阴性,CD44和CD90为强阳性,符合间充质干细胞细胞表面标记物特点。与对照组相比,抑制组细胞存活率升高,JNK信号通路因子RAC 1、ATF 2 mRNA转录水平明显下降,多能性相关基因CBX 4、Sox2的mRNA表达水平明显升高。结果表明通过抑制JNK信号通路有助于cBMSCs多能性基因的表达从而维持cBMSCs的多能性。

bFGF培养体系中添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响

为筛选出能够维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like)多能性的因子,以oESC-like为材料,在N2B27/CH/bFGF培养体系中,分别加入PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4,培养细胞8 d,分析绵羊类胚胎干细胞多能性,确定最适培养体系。结果显示:在N2B27/CH/bFGF培养体系添加PD或PD/hLIF后,oESC-like细胞生长较好;所有培养液中oESC-like细胞的AKP染色及多能性候选基因Sox2和Oct4免疫荧光蛋白染色结果均呈阳性;添加PD后,多能性候选基因Oct4与Klf4 mRNA的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),Nestin与Lin28的表达量显著降低(P<0.01),Sox2与c-Myc升高但差异不显著。添加PD/hLIF后,Oct4的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),c-Myc、Klf4、Lin28表达量升高但不显著,Nestin和Sox2表达量降低但也不显著。以上结果表明:在oESC-like培养体系中,添加PD或PD/hLIF可能有利于维持绵羊类胚胎干细胞的多能性。

维持干细胞多能性关键基因被发现

健康报讯 日前，我国科学家首次发现并明确证实了决定小鼠干细胞多能性的关键基因决定簇。这是继我国科学家在国际上首次证明iPS细胞具有全能性后，在国际竞争最激烈的领域——干细胞多能性维持机制研究方面获得的又一重大突破。

维持干细胞多能性关键基因被发现

日前，我国科学家首次发现并明确证实了决定小鼠干细胞多能性的关键基因决定簇。这是继我国科学家在国际上首次证明iPS细胞具有全能性后，在国际竞争最激烈的领域一干细胞多能性维持机制研究方面获得的又一重大突破。

添加不同因子对绵羊类胚胎干细胞多能性的影响

为筛选出更有利于维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like cell)多能性的因子,在基础培养基N2B27/CH中,分别添加PD、PD+hLIF、PD+BPM4、PD+hLIF+BMP4,通过比较分析,初步筛选出了比本实验室原培养体系(N2B27/CH+bFGF)更利于维持oESC-like多能性的培养基添加因子。结果显示:基础培养基中添加PD、PD+hLIF后细胞生长较好,细胞之间的结合更加致密;各种培养基培养物都表达AKP与Sox2、Oct4免疫荧光蛋白等oESC-like多能性标志;4种不同培养基与bFGF相比,细胞的生长速度减慢;在基础培养基N2B27/CH中添加PD和PD+hLIF使多能性候选基因Lin28与c-Myc表达量极显著升高(P<0.01),Nestin的表达量极显著下调(P<0.01),加入PD+hLIF使Oct4表达量极显著上调(P<0.01)。因此,在oESC-like基础培养液N2B27/CH的基础上,添加PD或PD+hLIF更有利于oESC-like细胞多能性维持。

P53通过促进miR-145的表达抑制肺腺癌A549细胞的干细胞特性

目的:探讨P53抑制肺腺癌A549细胞干细胞特性及其机制。方法:收集2014年3月至2015年12月解放军第85医院胸外科手术切除的30例非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)患者癌组织及癌旁组织,采用Real-time PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中miR-145的表达。构建人P53基因的真核表达载体(pcDNA3.1-P53)和突变载体[pcDNA3.1-P53R273H(CGT-CAT)],设计靶向P53基因的siRNA,分别转染A549细胞;细胞分为对照转染组(Vector或NCsiRNA)和实验组(Flag-P53或P53-siRNA);Western blotting检测P53蛋白过表达和干扰效率,Real-time PCR检测OCT4和miR-145的表达,荧光双报告基因和Western blotting技术检测证实A549细胞中干细胞多能性调节基因(OCT4)为miR-145的靶标分子。结果:NSCLC组织中miR-145的表达水平明显低于癌旁组织[(2.31±0.13)vs(3.51±0.27),P<0.01];P53明显促进A549细胞中miR-145的表达[(1.84±0.14)vs(1.00±0.00),P<0.01];miR-145 mimics显著抑制A549细胞中pGL3-OCT4-3′-UTR活性(P<0.01)和OCT4蛋白表达水平(P<0.05),而转染miR-145抑制剂可进一步增加OCT4表达水平,且逆转P53对A549细胞的干细胞特性的抑制作用。结论:P53通过促进miR-145表达下调OCT4表达,进而明显抑制A549细胞的干细胞特性,该结果为肺腺癌的临床诊断和治疗提供了新途径。

张进研究员团队揭示核仁定位的RNA结合蛋白LIN28调控小鼠胚胎干细胞多能性状态与二细胞样状态转变机制

2021年7月31日,《蛋白和细胞》(Protein&Cell)在线发表了张进研究员团队有关RNA结合蛋白LIN28调控小鼠胚胎干(ES)细胞多能性状态与二细胞(2C)样状态转变的最新研究成果“LIN28 coordinately promotes nucleolar/ribosomal functions and represses the 2C-like transcriptional program in pluripotent stem cells”(https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-021-00864-5)。研究结果揭示了定位于核仁中RNA结合蛋白LIN28在小鼠早期胚胎发育过程中的新功能,以及LIN28介导的核仁完整性在ES-2C状态转变和基因表达调控中的作用,为早期胚胎发育过程中2C程序的调控提供一个新的机制。

能帮助干细胞保持其多能性的蛋白质

据2011年3月30日Hao Wu （Nature, 2011, [Epub ahead of print] ），美国北卡罗来纳大学的研究组发现了一种新方法，蛋白质Tetl能帮助干细胞保持其多能性。在最新的两项研究中，该研究组宏观地观察到蛋白质在小鼠基因组中的位置，揭示了其令人惊奇的双重功能，并提供了蛋白质的首个基因组内的位置及其产物——5-羟甲基胞嘧啶，被称为DNA的“第六个碱基”的基因组。该发现是理解细胞分化及癌症发展背后的分子机制的一大重要步骤。

西北农林科技大学干细胞与动物疾病团队等破译维持干细胞“多能性”的核心

日前,西北农林科技大学动物医学院干细胞与动物疾病团队等成功破译维持干细胞“多能性”的核心,鉴定出三个在胎盘哺乳动物中高度保守的超级增强子(SE-SOX2、SE-PIM1、SE-FGFR1)。相关成果《胎盘动物超级增强子维持干细胞多能性》在《美国科学院院报》(PNAS)在线发表。研究表明,超级增强子在哺乳动物中快速进化,并利用基因编辑技术证实SE-SOX2、SE-PIM1、SE-FGFR1是维持胎盘动物干细胞多能性所必须的三个保守性超级增强子。

肌源性干细胞在组织工程研究中的现状

肌源性于细胞位于骨骼肌肌纤维膜外，属于多能干细胞，具有多细胞系分化和自我更新能力。随着组织细胞工程学和基因工程学的发展，肌源性干细胞在组织工程等方面的应用已成为研究热点。

猫多能性基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

从含有猫Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的质粒中获取目的基因,将目的基因与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体LV5进行定向连接,构建慢病毒表达载体LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4、LV-c-Myc,将其连接产物分别转化至细菌感受态细胞中,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后测序,通过lipofectamine2000介导转染293T细胞对慢病毒进行包装并测定病毒滴度,探讨猫多能性基因Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc慢病毒载体的构建与包装。结果表明:经双酶切鉴定及测序分析,成功构建并包装出LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4及LV-c-Myc慢病毒载体,基因测序结果与目标序列完全一致,且病毒滴度均达到107 TU·mL-1以上。说明成功地构建了猫多能性基因慢病毒表达载体,获得稳定产生慢病毒颗粒的包装细胞株。