人胚生殖嵴干细胞多能性调节基因Oct4的克隆及其在大肠杆菌中的表达(英文)

目的 :克隆人胚生殖系细胞多能性调节基因Oct4 ,并使其在大肠杆菌中表达。 方法 :取 4～ 6周人胚胎分离生殖嵴和背侧肠系膜 ,利用RT PCR技术扩增编码Oct4的全长cDNA ,并插入到原核表达载体 pGEX5T中 ,构建成 pGEX5T Oct4重组质粒。β硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导使该基因在k80 2菌中表达。 结果 :用PCR方法扩增获得大小约 1 .1kb条带 ;全自动测序与GenBank中登录的序列 97%同源。获得了pGEX5T Oct4重组子并在k80 2菌中获得了表达 ,SDS PAGE分析有一特异性的 6 2 0 0 0条带。 结论 :扩增和克隆了人胚生殖系细胞多能性调节蛋白Oct4全长cDNA并在大肠杆菌中获得表达 。

人脂肪干细胞的生物学鉴定和多能性分子Oct4和Sox2的表达研究

目的探讨人脂肪干细胞(ASCs)多能性分子Oct4和Sox2的表达情况。方法利用胶原酶将人脂肪组织消化后,分离培养得到ASCs,绘制细胞生长曲线;应用流式细胞仪检测不同代数的P2、P3、P5的ASCs的表面标志物;应用诱导分化培养基诱导ASCs朝成脂、成软骨和成骨方向分化,分化后分别行油红O、阿尔辛蓝和茜素红特殊染色鉴定;应用免疫荧光技术分析P1、P2、P5、P6细胞中Oct4和Sox2的表达情况。结果原代及传代后各代ASCs呈成纤维样贴壁生长,形态均一,细胞群体倍增时间为31 h。各代ASCs均表达CD29、CD44、CD90(>90%)和CD105(>50%),不表达CD34和CD45(<1%);成脂、成软骨和成骨诱导后染色鉴定结果均为阳性;Oct4在P1、P2细胞中的表达位于细胞核内,而在P5、P6细胞的表达则位于胞质;Sox2在P1、P2细胞的胞质中表达,而在P5、P6细胞的胞质中几乎不表达。结论 ASCs具有间充质来源干细胞的一些共同特性及间充质谱系的多向分化潜能。多能性分子Oct4和Sox2在不同代数ASCs中的表达量及表达位置有一定差异,可能反应了各代ASCs分化潜能有所不同。

OCT4基因是成功化学性重编程人类干细胞的关键基因

据Hawkins KE 2017年2月1日[Mol Ther,2017,25（2）：427-442.]报道,英国伦敦大学学院和德国海涅大学的研究人员通过研究鉴别出了特殊的基因,该基因或能将人类的羊膜干细胞化学性地重编程为类似胚胎干细胞的多能干细胞。该研究对于开发用于储存及疗法开发的重编程细胞非常关键。

Oct4过表达对小鼠胚胎干细胞稳定性的影响

目的:初步研究Oct4过表达在维持体外培养胚胎干细胞多潜能性和自我更新的作用。方法:将Oct4基因构建到哺乳动物细胞高效表达载体上,对胚胎干细胞进行外源基因转染,并以绿色荧光蛋白为报告基因;进一步通过形态学方法和碱性磷酸酶活性鉴定,分析Oct4基因在胚胎干细胞中的过表达对干细胞的稳定性的影响。结果:在荧光显微镜下观察,通过GFP的高水平表达,测定Oct4基因实现在胚胎干细胞中的过表达;过表达Oct4基因胚胎干细胞增殖缓慢,并具有较高碱性磷酸酶活性。结论:Oct4基因在胚胎干细胞中的过表达有利于胚胎干细胞的自稳性。

P53通过促进miR-145的表达抑制肺腺癌A549细胞的干细胞特性

目的:探讨P53抑制肺腺癌A549细胞干细胞特性及其机制。方法:收集2014年3月至2015年12月解放军第85医院胸外科手术切除的30例非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)患者癌组织及癌旁组织,采用Real-time PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中miR-145的表达。构建人P53基因的真核表达载体(pcDNA3.1-P53)和突变载体[pcDNA3.1-P53R273H(CGT-CAT)],设计靶向P53基因的siRNA,分别转染A549细胞;细胞分为对照转染组(Vector或NCsiRNA)和实验组(Flag-P53或P53-siRNA);Western blotting检测P53蛋白过表达和干扰效率,Real-time PCR检测OCT4和miR-145的表达,荧光双报告基因和Western blotting技术检测证实A549细胞中干细胞多能性调节基因(OCT4)为miR-145的靶标分子。结果:NSCLC组织中miR-145的表达水平明显低于癌旁组织[(2.31±0.13)vs(3.51±0.27),P<0.01];P53明显促进A549细胞中miR-145的表达[(1.84±0.14)vs(1.00±0.00),P<0.01];miR-145 mimics显著抑制A549细胞中pGL3-OCT4-3′-UTR活性(P<0.01)和OCT4蛋白表达水平(P<0.05),而转染miR-145抑制剂可进一步增加OCT4表达水平,且逆转P53对A549细胞的干细胞特性的抑制作用。结论:P53通过促进miR-145表达下调OCT4表达,进而明显抑制A549细胞的干细胞特性,该结果为肺腺癌的临床诊断和治疗提供了新途径。

基于Oct4基因启动子活性的高通量药物筛选细胞模型的构建及应用

目的 以人源Oct4基因启动子为靶点构建双荧光素酶报告基因载体,建立高通量药物筛选细胞模型,筛选能显著上调Oct4基因启动子活性的海洋来源微生物次级代谢产物。方法 将人源Oct4基因启动子序列克隆至萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL6-TA,构建重组质粒pGL6-TA-Oct4-luc并与内参质粒p RL-SV40-C瞬时共转染293T细胞,以OAC1作为激活剂,建立双荧光素酶报告基因筛选系统,通过检测相对荧光素酶表达水平的变化反映Oct4基因启动子活性,对309份海洋来源微生物发酵粗提物样品进行活性筛选;CCK-8法检测粗提物对间充质干细胞活力的影响。结果 双酶切和基因测序法证实重组质粒构建正确;将质粒转染293T细胞后,与空载pGL6-TA相比较,重组质粒pGL6-TA-Oct4-luc具有显著启动子活性(P<0.05);与0μmol/L相比较,粗提物Z-179-1处理细胞24 h后Oct4基因启动子活性明显升高(P<0.05),作用质量浓度为10μg/mL时效果最为显著;CCK-8法检测结果显示Z-179-1显著促进间充质干细胞的增殖,且呈剂量依赖性。结论 成功建立了靶向人源Oct4基因启动子的药物高通量筛选细胞模型,并筛选出海洋来源微生物发酵粗提物Z-179-1,能显著活化Oct4基因启动子,其活性成分值得开展进一步化学研究。

MicroRNAs与OCT4基因之间的相互作用

OCT4基因是POU转录因子家族中的一员,它能与含八聚体基序(ATGCAAAT)的DNA结合。OCT4是一个关键的转录因子,在未分化胚胎干细胞中参与维持多能性和自我更新性,在许多种癌症包括肺癌、生殖细胞肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和卵巢癌中过表达。Micro RNAs(mi RNAs)是一种小的非编码RNA,通过和靶基因m RNA碱基配对来调控m RNA表达,降解m RNA或阻碍蛋白合成。一些mi RNAs被证实在癌细胞中调控干细胞因子如OCT4、NANOG、SOX2和KLF4,进而调控癌细胞的增殖、凋亡、分化、抗药性和免疫性。

小鼠胚胎成纤维细胞重编程为多能干细胞

背景:目前胚胎干细胞研究面临伦理争议及来源困难等诸多问题,人们一直在寻找不需破坏胚胎或卵细胞的建立多潜能干细胞的方法。目的:构建小鼠诱导性多潜能干细胞系并对其进行鉴定。方法:利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入小鼠胚胎成纤维细胞中,将其诱导为多潜能干细胞。通过镜下观察、碱性磷酸酶染色、反转录PCR(RT-PCR)、免疫荧光实验及畸胎瘤形成实验等对诱导性多潜能干细胞形态、多能性基因表达情况、干细胞表面标记及全能性等进行鉴定分析。结果与结论:从小鼠胚胎成纤维细胞诱导而来的诱导性多潜能干细胞镜下观察呈典型的克隆状生长,圆形或椭圆形,与饲细胞分界清楚;RT-PCR、碱性磷酸酶染色及免疫荧光检测诱导性多潜能干细胞高表达胚胎干细胞相关基因及蛋白;种植在免疫缺陷鼠体内能够形成向内中外3个胚层分化的畸胎瘤,表明诱导性多潜能干细胞具有多潜能性。通过转导3种重编程因子可以将小鼠成纤维细胞诱导为类似胚胎干细胞的多潜能干细胞。

Oct4蛋白在儿童肾母细胞瘤中的表达及临床预后

肾母细胞瘤又称为韦尔姆瘤（Wilm tumor）,占小儿实体瘤的8%,并有一定的家族遗传性,其发病机制与WT基因突变和（或）肾源性剩余有关,前者从基因角度阐述,后者强调胚胎期肾组织,但两者都有相应的局限性。八聚体结合蛋白4（Oct4）是胚胎干细胞保持自我更新、维持未分化状态的主要调控因子,但在多种恶性肿瘤组织中呈现过表达。

转录因子Oct4、Nanog及相关调控网络与多能干细胞特性的维持

多能干细胞具有自我更新能力和高度增殖、多向分化的潜能。其特征的维持受到多种调控因子通过多条调控途径所形成网络的精密调节。Oct4、Nanog是调控网络中的核心因子,通过与靶基因调控区的结合选择性地抑制分化基因的表达或者激活多能性基因的表达而达到调控目的,此调控过程有时间和空间上的特异性。Oct4等也是细胞重编程不可或缺的转录因子。通过多种方法的研究各个击破网络结点上的关键因子,调控网络的调控机制自然会日渐明朗。

LRH-1在女性生殖和乳腺癌中的研究进展

肝受体类似物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1;NR5A2)是转录因子家族中的新成员,表达于肝、肠、胰腺和卵巢,尤其在卵巢高表达,参与胚胎发育的调节.近年来发现LRH-1还表达于人类乳腺中未分化脂肪组织的间质层,可能参与前脂细胞功能调节或脂肪细胞分化.因此对LRH-1的研究有助于揭示LRH-1与人类生殖及疾病的关系,为疾病的早期诊断和有效治疗提供了新靶点.

小鼠胚胎干细胞中天然反义转录物的表达及功能研究

非编码RNA(ncRNA),如小分子RNA和基因间长链非编码RNA在调控多能性方面发挥着重要的作用.然而,天然反义转录物(NAT)在胚胎干细胞中的作用并不清楚.本研究首先通过数字基因表达谱发现在小鼠胚胎干细胞中存在广泛的NAT表达,随后证实了Oct4,Nanog和Sox2这3个关键的多能性基因存在NAT的表达.并且,过表达Sox2的NAT可以在蛋白水平上降低Sox2的表达,同时在转录水平上对Sox2有轻微的上调作用.总之,本研究数据表明,NAT和其他的ncRNA一样,参与了多能性的维持.

调控胚胎干细胞自我更新的关键转录因子研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)具有自我更新和发育多能性的特点,在再生医学研究中有着广泛的应用前景。ES细胞多能性和自我更新的维持受到复杂的调控,涉及到转录调控、信号转导以及表观遗传调控等多个方面。转录因子Oct4、Sox2、Nanog在其中扮演着非常重要的角色,对干细胞特性的维持必不可少。本文着重讨论了这些关键转录因子的研究进展。这些研究促进了对ES细胞自我更新机制的深入理解,并为进一步的临床研究提供了理论基础。

信息

2011—21一种高效诱导多能性干细胞的重组腺病毒载体、使用该载体的诱导方法及其用途本发明提供一类用于诱导多能性干细胞（iPSceil）的重组腺病毒载体及其诱导多能性干细胞的方法。该类重组腺病毒载体的特征在于该重组腺病毒载体中的纤毛头基因是B亚群腺病毒纤毛头基因，且其中同时可操作地连接有Sox2和Oct4基因表达盒。