小鼠骨髓CD90+、CD34+、CD117+和Sca-1+细胞的肝干细胞潜能比较

目的比较的小鼠CD90+Lin-、C34+Lin-、CD117+Lin-和Sca-1+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能。方法供体为纯系BALB/C雄性小鼠,应用免疫磁珠分选法获取CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-和Sca-1+Lin-骨髓细胞。受体为35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB/C雌性小鼠,A、B、C、D组小鼠分别接受CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-、Sca-1+Lin-骨髓细胞移植。移植后30天活杀小鼠,取肝进行Y染色体原位分子杂交与白蛋白免疫组织化学联合检测。结果各组小鼠肝组织中都可以检测到Y染色体和白蛋白均呈阳性的双阳性细胞,C组的双阳性细胞数量显著多于其它各组。结论CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-、Sca-1+Lin-骨髓细胞都具有肝干细胞潜能,其中CD117+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能最大、形成肝细胞的能力量强。

模拟角膜缘干细胞微环境诱导人多潜能干细胞分化为角膜上皮细胞的研究

目的:探讨模拟角膜缘干细胞(LSCs)微环境诱导人多潜能干细胞(hiPSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性。方法:体外建立hiPSCs细胞系,利用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养模拟角膜缘干细胞微环境,添加小分子骨形态发生蛋白4(BMP4)和特异性转化生长因子β抑制剂(SB431542),诱导hiPSCs向角膜上皮细胞分化。采用免疫荧光染色、流式细胞方法检测角膜上皮细胞特异标志物CK3和CK12,角膜上皮细胞前体CK15,角膜缘干细胞标志物ABCG5的表达。结果:hiPSCs体外培养增殖活跃,免疫荧光染色显示干细胞特异性标志物OCT4、SOX2、TRA-1-60、NANOG呈阳性。采用transwell体系将hiPSCs与角膜基质细胞共培养,免疫荧光染色结果显示角膜缘干细胞标志物ABCG5及角膜上皮细胞前体标志物CK15阳性,角膜上皮细胞标志物CK3及CK12阴性;在共培养的基础上添加小分子BMP4和SB431542,免疫荧光染色及流式细胞检测结果显示角膜上皮细胞特异性标志物CK3阳性表达,且随分化时间延长表达比例增高。结论:模拟角膜缘干细胞微环境同时添加小分子SB431542及BMP4,可成功诱导体外培养的hiPSCs向角膜上皮细胞分化。

骨形态发生蛋白9定向诱导多潜能干细胞成骨分化

为确认和评价骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)定向诱导多潜能干细胞成骨分化的能力,以鼠间充质干细胞C3H10、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和骨髓基质细胞(bone marrow stromalcell,BMSC)三种多潜能干细胞为目标细胞,用重组腺病毒的方法将BMP9导入细胞,通过荧光素酶报告基因实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)定量测定、钙盐沉积实验、realtime PCR、动物实验和组织化学染色等方法,观察BMP9对于多潜能干细胞成骨分化的定向诱导作用.结果提示,BMP9能诱导C3H10、MEFs和BMSC细胞ALP的表达,且具有剂量依赖性.BMP9在体外能够促进C3H10细胞和MEFs细胞的钙盐沉积.经BMP9刺激后,C3H10细胞成骨相关基因ALP、Runx2、骨桥素(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OC)的mRNA水平均增加.荧光素酶报告基因实验证实,BMP9可以活化Smad和成骨关键基因Runx2.动物实验和组织化学染色检查显示,BMP9可以诱导C3H10细胞在裸鼠皮下异位成骨,因此,BMP9具有定向诱导多潜能干细胞成骨分化的能力.

诱导性多潜能干细胞(iPS cells)——现状及前景展望

主要从iPS细胞发展历程、获得iPS细胞的几个关键步骤(如基因导入方式、诱导iPS细胞所需因子组合与小分子化合物运用和体细胞种类选择等)、病人或疾病特异性iPS细胞、iPS细胞体内外诱导分化与其衍生物的临床应用和制备无遗传修饰的(genetic modification-free)iPS细胞的可行性与前景等方面对iPS细胞最新研究进展做评述.日本和美国研究小组先后用4种基因将小鼠(2006年8月)和人(2007年11～12月)的体细胞在体外重编程为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells),此后在短短两年多时间内,iPS细胞的研究和关注度呈爆炸式增长.体细胞重编程、去分化和多潜能干细胞来源等一系列热点问题再次成为干细胞和发育生物学等研究的热点和焦点.与胚胎干细胞(embryonic stem cells,EScells)一样,iPS细胞在体内可分化为3个胚层来源的所有细胞,进而参与形成机体所有组织和器官.迄今,在体外已由iPS细胞定向诱导分化出功能性的多种成熟细胞.因此,iPS细胞研究不仅具有重要理论意义,而且在再生医学、组织工程和药物发现与评价等方面极具应用价值.

诱导多潜能干细胞(iPSCs)的研究与应用进展

诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是体细胞在外源因子作用下,经直接细胞核程序重整而重新获得多潜能的干细胞.iPSCs在疾病的模型建立与机理研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值.在过去几年中,科学家们致力于改进体细胞重编程技术并取得许多突破.然而,为实现其在临床上的应用,必须克服体细胞重编程效率低和iPSCs成瘤风险两大挑战,而且重编程机制有待进一步阐明.结合iPSCs最新研究成果,评述了有关领域国内外研究进展,重点讨论当前存在问题,并展望未来研究方向.

Notch信号通路在骨形态发生蛋白9诱导的多潜能干细胞成骨分化中的作用

目的初步探讨Notch信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导多潜能干细胞成骨分化的作用和机制。方法腺病毒表达载体(AdBM P9/AdGFP、AdHey1/AdRFP)和BMP9/GFP条件培养基处理C2C12细胞,细胞化学染色和活性定量检测早期成骨标志物碱性磷酸酶(ALP),定量RT-PCR检测Notch信号通路靶基因Hey1,以了解Hey1在AdBMP9介导的成骨分化作用中的表达和作用;采用细胞密度实验和Notch信号通路抑制剂(DAPT)检测Notch信号通路对成骨的影响;在AdBMP9/AdGFP处理下,检测细胞上Notch信号通路配体、受体表达变化。结果 AdBMP9作用下,1、3、5、7dALP活性持续增加(P<0.05);Hey1一过性升高,其与AdBMP9呈剂量依赖性;Hey1可协助BMP9成骨(P<0.05),不能单独起效。80%和40%细胞密度组ALP量和Hey1表达均高于20%组(P<0.05);DAPT组中ALP活性明显降低(P<0.05);在AdBMP9作用下,Notch信号通路配受体有不同程度的上调,其中受体Notch4和配体Jag-1上调最为明显(分别为11.3倍和5.1倍)。结论 Notch信号通路参与BMP9介导的多潜能干细胞成骨分化,其可能的机制是BMP9通过诱导Notch通路配体、受体表达上调使Hey1升高,后者协同成骨。

人参皂苷Rg1干预骨髓间充质干细胞转化为多潜能干细胞关键基因mRNA的表达

背景:将成体细胞重编程为诱导多潜能干细胞方案主要通过反转录病毒将Oct-4,Sox2,c-Myc,Klf4等基因转入成体细胞而实现。目的:观察人参皂苷Rg1作用于骨髓间充质干细胞后,对成体细胞向诱导多潜能干细胞转化的关键性基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、NanogmRNA表达的影响。方法:培养骨髓间充质干细胞,对照组培养基为α-MEM,体积分数5%FBS,1%双抗;用药组培养基为α-MEM,体积分数15%FBS,1000U/mLRatESGRO,1%双抗,并加入6.25μmol/L和12.5μmol/L人参皂苷Rg1。检测骨髓间充质干细胞Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4,Nanog等mRNA的表达。结果与结论:人参皂苷Rg16.25μmol/L培养30d,Nanog、c-Myc、Oct、Klf4、Sox2mRNA表达均有升高,且Nanog、c-Myc与对照组差异有显著性意义。人参皂苷Rg1能促进骨髓间充质干细胞表达c-Myc,Nanog,但Nanog阳性的诱导多潜能干细胞在基因表达谱上很难与胚胎干细胞区分出来,提示人参皂苷Rg1对骨髓间充质干细胞向诱导多潜能干细胞转化可能具有促进作用。

鼠星形胶质细胞重编程为诱导多潜能干细胞的研究

目的研究星形胶质细胞重编程为诱导多潜能(iPS)干细胞的可行性,为进一步研究iPS细胞诱导技术奠定基础。方法用分别含Oct4,Sox2,Klf4和c-myc因子的4种逆转录病毒载体病毒颗粒感染星形胶质细胞,获得iPS细胞并进行鉴定。结果感染后第28天具有胚胎干细胞形态的克隆出现,诱导效率为(0.015±0.005)%,且碱性磷酸酶(AP)染色及SSEA-1和Oct4免疫荧光染色均显阳性。结论星形胶质细胞可以重编程为iPS细胞,进一步证明了iPS细胞诱导技术的普遍适用性。

肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞

目的重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞。方法包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞。结果诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2。结论肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台。

诱导多潜能干细胞治疗脊髓损伤的研究现状与进展

脊髓损伤是困扰医学界的难题。目前临床上的治疗方法效果均不理想。近20年来,干细胞技术飞速发展,在神经疾病和神经损伤的动物模型中应用胚胎和成体干细胞,取得了肯定的结果。在细胞水平上为治疗神经损伤提供了新的前景。但是由于技术和伦理方面的问题,获得可以应用于人类的合适的细胞资源仍有许多困难。最近诱导多功能干细胞的发现,为自体同源移植治疗脊髓损伤提供了新方法。本文将以此为出发点,评估诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的能力,以及在这一领域中的最新进展。

生物型人工肝的新种子细胞来源-诱导性多潜能干细胞

生物型人工肝在严重广泛肝细胞功能受损特别是急性肝衰竭的临床应用方面获得了一致认可,而肝细胞的获取是生物型人工肝的根本所在,无论是何种来源的肝细胞,获取后其功能正常高效发挥是所有工作的导向。因此,获取良好状态的人工肝种子细胞是一切工作的前提。由于分化、培养和增殖等方面的限制,获取人工肝种子细胞的常规途径并不能满足临床对种子细胞的需求。2006年日本学者通过重编程体细胞成功诱导成具有多分化潜能的iPS细胞,这为生物型人工肝在获取安全有效种子细胞来源方面带来了新的曙光,本文主要论述iPS细胞的来源、分化及其特性,以及将其应用于临床特别是生物型人工肝所面临的主要问题,并对其前景进行探讨。

诱导性多潜能干细胞技术及应用研究进展

对诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的研究技术进展、临床应用前景以及存在问题等方面进行了综述。

人诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)系的建立

掌握建立人iPS细胞系(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的技术,以便为人肿瘤细胞重编程为iPS细胞建立技术平台.在人胚胎干细胞的培养条件下,通过携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 4个混合因子的慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(CCD-1079SK细胞),从而诱导成干细胞样的克隆.根据人胚胎干细胞的特性进行如下鉴定:克隆形态、碱性磷酸酶活性、核型和CCD-1079SK细胞来源的克隆拟胚体(embryoid bodies,EBs)形成及分化等.结果显示,在人胚胎干细胞的培养环境中,导入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 4个因子的CCD-1079SK细胞产生了一株iPSC克隆,这株iPSC克隆在细胞形态、增殖能力、胚胎细胞特异性表面抗原以及基因表达与人胚胎干细胞相似,此外,iPSC克隆在体外悬浮培养中形成拟胚体并分化成3个胚层.人iPS细胞系的成功建立为利用iPS细胞技术开展肿瘤细胞重编程研究奠定了坚实基础.

多基因修饰小鼠诱导多潜能干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的观测胰岛素转录关键调控因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX-1)、神经分化因子1(NeuroD1)及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)对小鼠诱导多潜能干细胞(iPS细胞)分化为胰岛素分泌细胞的作用。方法筛选鉴定小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程的iPS细胞。以重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP联合感染小鼠iPS细胞,体外培养后以RT-PCR检测胰岛B细胞功能基因表达;免疫荧光检测胰岛素蛋白表达及定位;ELISA检测不同糖浓度(0、5、10、20、30、40mmol/L)下胰岛素的分泌量。结果起源于MEFs的iPS细胞能形成边缘光整的致密克隆,表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织,显示MEFs被成功地重编程为iPS细胞。Ad-PDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP感染的小鼠iPS细胞能分化为胰岛类B细胞,RT-PCR结果显示其胰岛B细胞功能基因的表达与小鼠胰岛B细胞株MIN6相似。免疫荧光检测可见胰岛类B细胞内有胰岛素表达。ELISA检测结果显示胰岛类B细胞对不同浓度葡萄糖有较好的反应性。结论胰岛素转录关键调控因子PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用,使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。

诱导性多潜能干细胞成骨分化的研究进展

诱导性多潜能干细胞(i PS Cell)是一种经人工诱导重新编程后产生的多潜能分化干细胞。目前,i PS细胞已成功再分化为多种不同的成熟细胞,其中包括成骨细胞。因此,利用i PS细胞诱导成骨以治疗骨组织疾病成为一个可期待的选择。本文回顾了i PS细胞成骨分化的体内外研究成果;除此之外,讨论了细胞因子及微小RNA(miRNA)对iPS细胞成骨分化的作用;最后,综述了各类支架对于iPS细胞成骨作用的影响,并分析了相关优缺点,以期为进一步实验及研究提供参考。

人脐血PSC3445多潜能干细胞体外分离培养与鉴定

目的 :培养、鉴定、描述及扩增人脐血PSC344 5多潜能干细胞 .方法 :使用Ficoll Hypaque分离新鲜人脐血单个核细胞 ,用PBS洗涤 2～ 3遍后在Potentculture完全培养液中37℃ ,5 0mL/LCO2 条件下培养 1 0～ 1 4d ,得到一群成纤维样细胞 ,该细胞与荧光素标记的mAb (CD1 4 PE ,CD1 1b PE ,CD4 5 FITC ,CD34 PE ,CD3 FITC ,CD1 0 5 PE ,CD1 6 6 PE ,CD2 9 PE ,CD90 FITC ,CD33 PE ,CD4 1 PE ,CD4 4 FITC ,CD7 FITC ,CD6 1 FITC ,HLA DR PE)反应后 ,经流式细胞仪检测其表面标志 .并对该细胞进行了糖原 (PAS) ,酸性磷酸酶 (AP) ,碱性磷酸酶(Alk .P) ,油红O(ORO) ,过氧化物酶 (POX)等化学染色 .结果 :PSC344 5表达 :HLA DR+ ,CD1 4 + ,CD4 5 + ,CD1 1b+ ,CD2 9+ ,CD34-,CD1 0 5 -,CD3-,CD90 -,CD1 6 6 -.细胞化学染色为PAS+ ,AP+ ,Alk .P-,ORO-,POX-.在适当诱导剂的诱导下可以定向分化 .结论

用精神分裂症患者皮肤成纤维细胞构建诱导性多潜能干细胞模型

目的将精神分裂症患者来源的人皮肤成纤维细胞(HDF)重编程为诱导性多潜能干细胞(i PSCs),为精神分裂症患者建立i PSCs模型。方法采用聚合酶链反应技术从p EP4EO2SEM2K质粒上扩增2条目的片段:OCT4-IRES2-SOX2和C-MYC-IRES2-KLF4,将其连接到慢病毒载体p LVX-IRES-m Cherry上。构建成功的质粒通过磷酸钙转染法转染293T细胞包装病毒,检测病毒活力后侵染患者皮肤成纤维细胞,将其去分化为诱导性多潜能干细胞,并检测其多能性。结果测序表明重组慢病毒载体构建成功,并制备了具有良好侵染活力的重组慢病毒。将含4种重编程因子的慢病毒颗粒侵染1例精神分裂症患者的HDF后,HDF的形态逐步发生变化,最终形成典型的i PSCs克隆。结论成功将1例精神分裂症患者成纤维细胞重编程为iPSCs,为以后建立更多精神分裂症疾病模型奠定基础。

电穿孔转染制备绵羊诱导多潜能干细胞条件的优化

为优化获得绵羊诱导性多潜能干细胞(iPS cell)的诱导条件,通过4-D电转染仪,将含有人Oct4、Sox2及Klf4、c-Myc及lin28基因的3个质粒共转染绵羊成纤维细胞,从EH-100、EN-150、CZ-167、CA-137电转程序筛选出适合绵羊成纤维细胞的电转染程序;探讨不同细胞密度、质粒质量浓度、质粒质量浓度比及维生素C对诱导性多潜能干细胞克隆形成的影响。结果表明,采用EH-100电转程序,在细胞密度为5×106 mL-1、质粒质量浓度比为1∶1∶1、质粒总质量浓度为0.1mg·L-1、培养液中添加维生素C的质量浓度为0.05mg·L-1时,AP染色阳性(AP+)克隆形成的效率可达到14.0%。说明,优化后的电转染方法和培养方案可有效提高绵羊诱导性多潜能干细胞的制备效率。

线粒体与多潜能干细胞功能

线粒体是细胞内重要的细胞器,主要功能是通过氧化磷酸化为细胞生命活动提供能量。近年来,研究表明,在多潜能干细胞(Pluripotent stem cells,PSCs)中线粒体表现出独有的特征,即在多能性状态下,PSCs主要依靠糖酵解提供能量,其分化期间线粒体氧化磷酸化代谢能力逐渐增强。相反,体细胞重编程为多潜能干细胞期间,线粒体氧化磷酸化向糖酵解途径的转变是其成功重编程必需的代谢过程。另外,线粒体通过生物合成和形态结构的动态重塑维持了PSCs多能性、诱导分化及诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,i PSCs)的重编程。因此,本文综述了PSCs线粒体形态结构及其在调控PSCs多能性、合成代谢、氧化还原状态的平衡、分化及重新编程中的作用,为深入了解线粒体调控PSCs功能的作用提供理论基础。