肿瘤抑制因子microRNA-218对前列腺癌细胞恶性进展及肿瘤干细胞特性的调控作用

目的 探究miRNA-218(miR-218)在调节前列腺癌(PCa)细胞干性以及上皮-间质转化(EMT)方面的作用。方法 通过慢病毒转染构建稳定过表达miR-218的前列腺癌细胞系,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测前列腺癌细胞中miR-218的表达;Transwell迁移实验检测不同组细胞迁移能力;Western blot检测各组细胞中EMT相关蛋白的表达;集落形成和肿瘤成球实验检测不同组别肿瘤干细胞特征。结果 qPCR结果显示,miR-218的表达水平在前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中较BPH-1显著下调;Transwell迁移实验结果表明,miR-218可抑制前列腺癌细胞的迁移作用;Western blot结果显示,过表达miR-218后,EMT相关蛋白表达受到抑制;在集落形成和肿瘤成球实验中,过表达miR-218可显著抑制前列腺癌细胞的干性特征。结论 miR-218在PCa细胞系中表达下调,且能抑制PCa细胞迁移、EMT和肿瘤干细胞特性。

肉桂醛对PC-3细胞增殖、EMT及干细胞特性的影响

目的 探索肉桂醛(cinnamaldehyde,CA)对PC-3细胞增殖、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及干细胞特性的作用及机制,为CA作为潜在抗前列腺癌骨转移药物提供前期实验参考。方法 通过CCK-8法、Transwell实验、基质黏附实验及成球实验检测CA对PC-3细胞增殖、迁移、侵袭、黏附及成球的影响,qRT-PCR分析CA处理PC-3细胞后miR-143及AGO2 mRNA表达情况,Transwell实验和基质黏附实验检测单独加入CA、转染miR-143mimic、AGO2-siRNA同时处理CA及AGO2、同时转染miR-143mimic及AGO2后PC-3细胞的侵袭、迁移及黏附情况。Western blot实验检测CA或转染miR-143mimic后PC-3细胞AGO2、EMT及干细胞特性相关蛋白的表达情况。结果 CA呈浓度依赖性抑制PC-3细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附及成球能力,与对照组相比差异均有统计学意义(P <0.01);qRT-PCR分析发现CA可上调PC-3细胞中miR-143表达、抑制AGO2 mRNA表达;过表达miR-143及沉默AGO2均能抑制PC-3细胞的迁移、侵袭及黏附,而同时上调AGO2及CA、同时上调miR-143及AGO2后PC-3细胞迁移、侵袭及黏附的抑制作用并不明显。此外,过表达miR-143及CA均能抑制PC-3细胞中AGO2、ZEB1、Vimentin、N-cadherin、fibronectin及CD44、Oct-4、c-Myc蛋白的表达。结论 CA可在体外抑制PC-3细胞的增殖、迁移、侵袭及黏附能力,此外,CA可抑制PC-3细胞的EMT及干细胞特性,其机制可能与其能上调miR-143/AGO2轴有关。

接触脑脊液神经元及其神经干细胞特性相关研究进展

接触脑脊液神经元(CSF-cNs)是中间神经元的一个亚群,在中央管内表现为顶端球状延伸,并将基底轴突投射发送到其他细胞。虽然CSF-cNs早在近一个多世纪前就被发现了,但其具体特征和功能才刚刚开始被揭示。最近大量研究详细阐述了CSF-cNs的特征,包括形态、分类、空间分布及特异性标志物等。随着对CSF-cNs的深入探索,现有部分研究者发现其可能是位于脊髓中央管及其周围的神经干细胞,在脊髓损伤后可能发挥很重要的作用。因此,本文对国内外关于CSF-cNs及其神经干细胞特性的相关研究进展进行综述如下。

连翘苷通过Wnt/β-catenin通路抑制体内外结肠癌增殖和干细胞特性

[目的]探究连翘苷对结肠癌的抑制作用及其可能的机制。[方法]将结肠癌SW480细胞分为对照组,连翘苷低、中、高浓度组和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)组。以噻唑蓝(methy thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活性,克隆形成试验检测连翘苷对SW480细胞增殖的作用,微球体形成试验检测干细胞成球直径和成球数量,定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测Nanog、性别决定区Y盒子2(sex-determining region Y box 2,SOX2)、醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)、八聚体结合转录因子4(octamer binding transcription factor 4,OCT4)、Wnt、β-catenin和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)mRNA的相对表达水平,免疫印迹检测Nanog、SOX2、ALDH1、OCT4、Wnt、β-catenin、磷酸化GSK-3β(phospho-GSK-3β,p-GSK-3β)和GSK-3β蛋白的相对表达水平。建立结肠癌异种移植瘤模型,观察连翘苷对体内结肠癌生长的效应,免疫组化检测移植瘤组织中Ki-67、Nanog和SOX2的阳性表达量,免疫印迹检测结肠癌异种移植瘤组织中Wnt和β-catenin蛋白的表达量。[结果]与对照组比较,连翘苷各浓度组SW480细胞活性和克隆形成数降低(P<0.05,P<0.05),干细胞成球直径和成球数量降低(P<0.05,P<0.05),Nanog、SOX2、ALDH1、OCT4、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白相对表达水平降低(P<0.05,P<0.05),p-GSK-3β蛋白表达水平降低(P<0.05),而GSK-3β蛋白相对表达水平升高(P<0.05)。在体内实验中,与控制组比较,实验组的结肠癌异种移植瘤质量减轻(P<0.05),异种移植瘤组织中Ki-67、Nanog和SOX2的阳性表达下调(P<0.05,P<0.05,P<0.05),Wnt和β-catenin蛋白表达下调(P<0.05,P<0.05)。[结论]连翘苷能抑制体内外结肠癌细胞增殖及干细胞特性,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路有关。

食管癌Eca109单克隆细胞株的干细胞特性研究

为分离及鉴定食管癌Eca109肿瘤干细胞。将购买上海生命科学研究院的食管癌Eca109细胞株采用有限稀释法进行单克隆培养并进行HE染色;应用免疫细胞化学技术检测Eca109单克隆细胞株中P75NTR、Oct-4的表达;MTT法和平板克隆实验检测细胞体外增殖情况。Transwell小室法检测各细胞株侵袭能力。结果显示,HE染色示细胞形态有圆形、核大和短梭形、核小两种;在Eca109单克隆的细胞中P75NTR强表达、Oct-4表达相对较弱,且在圆细胞株中表达定位于胞核;MTT法测增殖示圆细胞株增殖率明显高于其他细胞株,差异有统计学意义(P<0.001);平板克隆实验示圆细胞株形成克隆团数高于其他细胞株且细胞团大;Transwell法结果示各细胞株侵袭能力相当。由此可知,Eca109细胞中P75NTR、Oct-4核表达阳性的圆细胞有可能为食管癌干细胞。

缺氧诱导肝癌细胞获得干细胞特性的初步实验研究

目的:观察缺氧对肝癌干细胞特性的影响。方法:用肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721建立细胞缺氧培养模型,利用倒置显微镜观察细胞形态学变化;克隆形成实验检测肿瘤细胞克隆形成能力;"肿瘤球"形成实验检测肿瘤细胞自我更新能力;实时定量RT-PCR和Western blot检测干细胞相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog mRNA和蛋白表达;采用流式细胞术检测干细胞表面标志物CD133表达。结果:缺氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞克隆形成率显著高于常氧组(P<0.05)。缺氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞肿瘤球形成率显著高于常氧组(P<0.05)。常氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞中干细胞相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog mRNA及蛋白表达水平极低,缺氧处理48 h后,其mRNA及蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。缺氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞CD133阳性表达率表达量显著增加(P<0.05)。在缺氧36 h和48 h,CD133蛋白表达水平显著增强(P<0.05)。结论:缺氧能诱导肝癌细胞干细胞特性的获得。

肺癌耐顺铂细胞A549/CIS产生肿瘤干细胞特性的分子机制研究

目的研究人肺癌耐顺铂细胞A549/CIS获得肿瘤干细胞特性的分子机制。方法微球形成实验比较A549和A549/CIS细胞肿瘤干细胞特性的差别,以及磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶(PI3K/AKT)通路抑制剂LY294002对A549/CIS细胞微球形成能力的影响。Western blotting检测A549和A549/CIS细胞中AKT、p65以及MAPK-p38信号通路的活化情况。CCK8实验检测A549和A549/CIS细胞对顺铂的敏感性,以及PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对A549/CIS细胞对顺铂敏感性的影响。结果A549/CIS细胞对顺铂的敏感性以及微球形成能力相对于A549明显增强,Western blotting结果表明:A549/CIS细胞中AKT通路明显被激活,而p65和MAPK-p38通路没有明显变化。LY294002可以抑制A549/CIS细胞的肿瘤干细胞特性,并提高A549/CIS细胞对顺铂的敏感性。结论相对于敏感株细胞A549,耐药株A549/CIS细胞的肿瘤干细胞特性明显增强,而其机制涉及PI3K/AKT信号通路的激活。

Hedgehog-Gli信号通路调控EMT驱动前列腺癌干细胞特性形成的初步实验研究

目的探索上皮间质转化EMT与肿瘤干细胞之间潜在联系及相关机制。方法应用免疫组织化学染色方法检测前列腺癌组织中肿瘤干细胞标志物表达情况。应用Q-PCR及Western blot方法检测分析ARCaPE和ARCaPM细胞中EMT及肿瘤干细胞相关标志物表达水平。应用细胞集落形成实验比较ARCaPE和ARCaPM细胞增殖能力。应用肿瘤克隆球形成实验检测细胞克隆形成和自我更新能力。应用GANT61封闭Hedgehog-Gli信号通路,分析Hedgehog-Gli通路阻断后ARCaPM细胞EMT及干细胞特性的变化。结果 CD44在前列腺癌中表达下调,且与分级相关,高级别(Gleason≥8)前列腺癌组织中下调更明显;Nanog在高级别前列腺癌中有表达增高现象;而CD133在前列腺良性增生中和前列腺癌中均为阴性染色。具有间质细胞样形态的ARCaPM细胞迁移侵袭能力较具有上皮细胞样形态的ARCaPE细胞明显增强,E-cadherin表达降低,N-cadherin、Vimentin、Snail表达增加。ARCaPM细胞中肿瘤干细胞分子标志物表达增高,其增殖及自我更新能力均明显增强。Gli1在ARCaPM细胞中表达增高,Gli抑制剂GANT-61可以有效抑制ARCaPM细胞EMT转化,降低其肿瘤干细胞分子标志物表达水平,抑制其增殖及自我更新能力。结论 Hedgehog-Gli信号通路调控的EMT可驱动前列腺癌细胞肿瘤干细胞特性形成。

P53通过促进miR-145的表达抑制肺腺癌A549细胞的干细胞特性

目的:探讨P53抑制肺腺癌A549细胞干细胞特性及其机制。方法:收集2014年3月至2015年12月解放军第85医院胸外科手术切除的30例非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)患者癌组织及癌旁组织,采用Real-time PCR检测NSCLC组织和癌旁组织中miR-145的表达。构建人P53基因的真核表达载体(pcDNA3.1-P53)和突变载体[pcDNA3.1-P53R273H(CGT-CAT)],设计靶向P53基因的siRNA,分别转染A549细胞;细胞分为对照转染组(Vector或NCsiRNA)和实验组(Flag-P53或P53-siRNA);Western blotting检测P53蛋白过表达和干扰效率,Real-time PCR检测OCT4和miR-145的表达,荧光双报告基因和Western blotting技术检测证实A549细胞中干细胞多能性调节基因(OCT4)为miR-145的靶标分子。结果:NSCLC组织中miR-145的表达水平明显低于癌旁组织[(2.31±0.13)vs(3.51±0.27),P<0.01];P53明显促进A549细胞中miR-145的表达[(1.84±0.14)vs(1.00±0.00),P<0.01];miR-145 mimics显著抑制A549细胞中pGL3-OCT4-3′-UTR活性(P<0.01)和OCT4蛋白表达水平(P<0.05),而转染miR-145抑制剂可进一步增加OCT4表达水平,且逆转P53对A549细胞的干细胞特性的抑制作用。结论:P53通过促进miR-145表达下调OCT4表达,进而明显抑制A549细胞的干细胞特性,该结果为肺腺癌的临床诊断和治疗提供了新途径。

miR-145反向调节WT-p53对前列腺癌细胞EMT和干细胞特性的抑制作用

目的通过改变miR-145在前列腺癌(PCa)细胞中的表达,揭示miR-145反向调节野生型p53(WT-p53)抑制前列腺癌细胞EMT和干细胞特性的作用机制。方法本研究采用低表达WT-p53的PCa骨转移细胞系PC-3作为研究对象,使其外源性表达WT-p53,在细胞生物学层面检测其迁移、侵袭、黏附等转移相关能力的变化,在分子生物学层面检测其Fibronectin、E-Cadherin和Vimentin等EMT表征蛋白的表达水平;同时通过观察其肿瘤球的形成能力变化,检测WT-p53上调对PC-3干细胞特性的影响。最后用miR-145的拮抗分子反向验证上述过程。结果 PC-3细胞高表达外源性WT-p53后,其迁移和侵袭能力受到了显著抑制,同时其黏附能力也明显增强。在分子层面,高表达WT-p53抑制了PC-3细胞中Fibronectin和Vimentin的表达,并同时上调了E-Cadherin的表达水平,表明PC-3的EMT受到了抑制。另一方面,高表达WT-p53的PC-3细胞的肿瘤球形成能力明显下降,表明PC-3的干细胞特性得到了有效抑制。更为重要的是,miR-145的拮抗分子能够逆转WT-p53对PC-3细胞侵袭性、EMT和干性的抑制作用。结论 WT-p53的突变甚至缺失可能促进PCa的骨转移,而这一过程可能是通过(至少部分通过)抑制miR-145的表达从而促进癌细胞的EMT和干性表达来完成。

ALDH1高表达对乳腺癌细胞MCF-7干细胞特性的影响

目的探讨ALDH1高表达对乳腺癌MCF-7细胞干细胞特性的影响,为乳腺癌的治疗提供理论依据。方法构建慢病毒ALDH1RNA,转染乳腺癌MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选稳定高表达ALDH1的亚克隆,命名为MCF-ALDH1细胞株。荧光定量PCR和Western blot法检测MCF-ALDH1细胞株及对照细胞中ALDH1在mRNA和蛋白水平的表达;克隆形成实验、悬浮球形成实验及裸鼠成瘤实验检测MCF-ALDH1及对照组细胞的干细胞特性,MTT法测定细胞的耐药性。结果与MCF-7组细胞比较,MCF-ALDH1细胞株的ALDH1在mRNA和蛋白表达量明显升高;MCF-ALDH1细胞克隆形成数目为128±22个,高于MCF-ALDH1细胞球克隆形成数(46±15个);悬浮成球实验,MCF-ALDH1细胞悬浮成球数目明显增多(16±2个),高于对照细胞悬浮球数(8.0±1.5个);肿瘤细胞在裸鼠皮下接种后,MCF-7细胞组有3只裸鼠成瘤,MCF-ALDH1有5只成瘤,瘤体积明显大于MCF-7组,差异有统计学意义(P<0.05)。耐药实验显示,MCF-ALDH1对顺铂、紫杉醇的耐药性明显提高。结论高表达ALDH1的乳腺癌MCF-7细胞干细胞特性增强,ALDH1可能成为乳腺癌治疗的靶点之一。

SHOX2体外增强膀胱癌细胞的迁移、侵袭和干细胞特性

目的探讨人矮小同源盒基因2(SHOX2)对人膀胱癌细胞迁移、侵袭能力和干细胞特性的影响及其可能机制。方法分析TCGA肿瘤数据库中SHOX2基因在膀胱癌标本和癌旁对照标本的表达情况,利用GEPIA网站对TCGA膀胱数据中的SHOX2基因表达量进行单因素生存分析,并利用GSEA软件预测其可能的生物学功能。选取对数生长期的人膀胱癌细胞T24,采用SHOX2 sh RNA及SHOX2过表达质粒分别敲低、过表达SHOX2基因,用Western blot检测SHOX2蛋白表达量,通过划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力,悬浮成球、克隆形成实验检测细胞的干细胞特性。在光镜下观察细胞形态变化,并用Western blot检测细胞上皮间充质转化(EMT)标志分子E-cadherin、Vimentin蛋白表达量的变化和TGF-β信号通路重要组件TβR-I蛋白表达量的变化。结果与癌旁膀胱组织相比,SHOX2基因在TCGA膀胱癌组织中表达升高(P=0.01),在配对的膀胱癌组织中明显升高(P=0.001),SHOX2基因表达与总生存率呈负相关(P=0.01);GSEA显示SHOX2基因表达与EMT(P=0.002,P=0.03)及干细胞特性(P=0.006,P=0.008)呈正相关。在膀胱癌细胞T24中,两种不同的SHOX2 sh RNA均能降低SHOX2的蛋白表达水平(sh SHOX2-1,P=0.004;sh SHOX2-2,P=0.03),SHOX2过表达质粒则能提高SHOX2的蛋白表达水平(P=0.007)。划痕实验、Transwell侵袭实验结果显示,抑制SHOX2表达后膀胱癌细胞的迁移(P<0.001,P=0.02)、侵袭(P=0.002,P=0.003)能力明显降低,而SHOX2过表达则提高膀胱癌细胞的迁移(P<0.001)、侵袭(P=0.004)能力。悬浮成球、克隆形成实验结果显示,抑制SHOX2表达后明显减弱膀胱癌细胞的干细胞特性(P=0.002,P=0.007,P<0.001);而SHOX2过表达则增强膀胱癌细胞的干细胞特性(P=0.002,P<0.001)。此外,抑制SHOX2表达可使细胞发生上皮样形态改变,而SHOX2过表达可使细胞发生间充质样形态改变;Western blot结果显示,抑制SHOX2表达可使膀胱癌细胞中的E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.001),Vimentin(P<0.001,P=0.01)、TβR-I(P=0.03,P=0.02)蛋白表达水平降低;而SHOX2过表达可使膀胱癌细胞中的Vimentin(P=0.04)、TβR-I(P=0.003)蛋白表达水平升高。结论SHOX2在膀胱癌中扮演致癌基因:SHOX2增强膀胱癌细胞的迁移、侵袭能力和干细胞特性,其作用机制可能与TGF-β信号通路参与调控的EMT有关。

DNA结合分化抑制蛋白-1促进乳腺癌细胞干细胞特性与血管形成的机制初探

目的探究DNA结合分化抑制蛋白-1(ID-1)对乳腺癌细胞干细胞特性与血管形成的影响及其分子机制。方法免疫组织化学染色检测乳腺癌组织和癌旁组织中ID-1表达;将SUM159细胞以脂质体介导转染法过表达或抑制ID-1水平,分为Control组、shRNA-NC组、shRNA-ID-1组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-ID-1组,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测转染效果;平板集落形成实验检测细胞集落形成能力,肿瘤球形成实验检测细胞自我更新能力,小管形成实验检测HUVECs成管能力,免疫荧光染色法和Western blot检测Src激酶活化情况。结果乳腺癌组织中ID-1阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.05);转染shRNA-ID-1可抑制SUM159细胞中ID-1 mRNA与蛋白表达(P<0.05),在SUM159细胞中抑制ID-1表达后,细胞集落形成数目减少(P<0.05),肿瘤球体体积变小,球体数目减少(P<0.05),HUVECs形成的分支点数减少(P<0.05),p-Src荧光表达减弱,p-Src蛋白表达水平下调(P<0.05);转染pcDNA3.1-ID-1可提高SUM159细胞中ID-1 mRNA与蛋白表达(P<0.05),而过表达ID-1能够增加细胞集落形成数目(P<0.05),使肿瘤球体体积增大,球体数目增多(P<0.05),HUVECs形成的分支点数增加(P<0.05),同时,细胞内p-Src荧光表达明显增强,p-Src蛋白表达水平上调(P<0.05)。结论ID-1能够增加乳腺癌细胞干细胞特性,促进乳腺癌血管形成,这一作用机制可能与激活Src激酶途径相关。

健脾养正消癥汤通过抑制有氧糖酵解对胃癌HGC-27细胞增殖及干细胞特性的影响

目的:观察健脾养正消癥汤通过抑制有氧糖酵解过程而对人胃癌细胞HGC-27增殖过程及干细胞特性的影响,并探讨其具体机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法测定健脾养正消癥汤(0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 g·L^(-1))处理胃癌细胞HGC-27的存活率及化疗敏感性的变化;细胞克隆形成实验检测健脾养正消癥汤(2、4、8 g·L^(-1))对细胞克隆形成能力的影响;葡萄糖检测试剂盒和乳酸测定试剂盒检测健脾养正消癥汤处理后胃癌细胞有氧糖酵解水平的变化;流式细胞术检测胃癌HGC-27细胞中干细胞亚群的比例;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胃癌细胞中乳酸脱氢酶(LDH)及己糖激酶2(HK2)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)等糖酵解相关蛋白的表达及八聚体结合转录因子4(OCT4)、SRYbox转录因子2(SOX2)、Nanog等干细胞特性相关蛋白的表达。结果:MTT比色法结果表明,与空白组比较,健脾养正消癥汤(0.5、1、2、4、8、16、32 g·L^(-1))组能够抑制胃癌HCG-27细胞活力(P<0.05,P<0.01),其半数抑制浓度(IC_(50))为4.83 g·L^(-1),且健脾养正消癥汤能够提高胃癌HGC-27细胞对顺铂化疗的敏感性;克隆形成实验表明,与空白组比较,健脾养正消癥汤(2、4、8 g·L^(-1))均能显著减少胃癌HGC-27细胞克隆形成数(P<0.01),且呈现浓度依赖性;流式细胞术表明,与空白组比较,健脾养正消癥汤(2、4、8 g·L^(-1))作用后细胞的CD44^(+)CD24^(+)ALDH^(+)细胞亚群比例率明显降低(P<0.05);葡萄糖检测和乳酸检测表明,与空白组比较,健脾养正消癥汤(2、4、8 g·L^(-1))能有效抑制胃癌细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成(P<0.01);Western blot表明,与空白组比较,健脾养正消癥汤(2、4、8 g·L^(-1))能下调SOX2、Nanog、OCT4等干性相关蛋白及PKM2、LDH、GLUT1、HK2等有氧糖酵解途径相关蛋白的水平(P<0.05,P<0.01),并呈浓度依赖性。结论:健脾养正消癥汤对胃癌细胞增殖具有明显抑制作用,且能够降低胃癌干细胞特性,其作用机制可能与干预胃癌的糖代谢通路—有氧糖酵解有关。

骨形态发生蛋白9对肝细胞癌肿瘤干细胞干性、增殖和侵袭的影响及机制

目的探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)对肝细胞癌(HCC)肿瘤干细胞(CSCs)干性、增殖和侵袭的影响及机制。方法取对数生长期的正常肝细胞、肝癌细胞、肝癌CSCs,采用RT-qPCR法检测BMP9 mRNA表达,采用Western blotting法检测BMP9蛋白表达。采用慢病毒干扰载体转染肝细胞癌肿瘤干细胞(HepG2-CSCs)以敲低BMP9表达,并分成HepG2-CSCs组、HepG2-CSCs-BMP9敲低组。加入MAPK/ERK信号激动剂(DIPQUO)后,将细胞分为三组:HepG2-CSCs组、HepG2-CSCs敲低组及HepG2-CSCs敲低+DIPQUO组。采用RT-qPCR实验检测HepG2-CSCs干性相关分子CD44、SOX2和OCT4表达,采用CCK-8实验检测细胞增殖能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力,采用蛋白印迹法检测MAPK/ERK通路关键蛋白表达。结果与正常肝细胞比,肝癌细胞和肝癌肿瘤干细胞(HepG2-CSCs)中BMP9表达上调(P<0.05)。HepG2 CSCs细胞中BMP9 mRNA和蛋白表达高于HepG2细胞(P均<0.05)。BMP9敲低后,HepG2-CSCs-BMP9敲低组中HepG2-CSCs细胞中干细胞相关标志物CD44、SOX2、OCT4 mRNA表达较HepG2-CSCs组降低(P均<0.05)。与HepG2-CSCs组比较,HepG2-CSCs-BMP9敲低组中HepG2-CSCs在48、72和96 h的细胞增殖能力降低(P均<0.05),HepG2-CSCs细胞迁移和侵袭能力降低(P均<0.05)。较HepG2-CSCs组,HepG2-CSCs-BMP9敲低组中HepG2-CSCs中p-ERK1/2和p-MEK1/2蛋白表达显著降低(P均<0.05)。HepG2-CSCs敲低+DIPQUO组HepG2-CSCs中干细胞相关标志物CD44、SOX2、OCT4 mRNA表达增加(P均<0.05),HepG2-CSCs增殖和侵袭能力增强(P均<0.05)。结论BMP9敲低可抑制HepG2-CSCs干性维持并抑制细胞增殖、降低侵袭能力,机制可能与抑制MAPK/ERK信号通路有关。

壁虎对肝细胞癌干细胞特性的影响及其机制

研究壁虎对肝癌干细胞特性的影响,并探讨其分子机制。采用MTT法检测肝癌细胞增殖;肿瘤球培养和流式细胞术检测肝癌干性;Western blot检测Wnt通路及干性相关蛋白的表达;免疫共沉淀检测相互作用蛋白;皮下移植瘤模型检测肝癌细胞的干性。结果显示,壁虎对Huh7细胞的IC_(50)为(0.750±0.112)g·mL^(-1),其对Hep3B细胞的IC_(50)为(0.454±0.039)g·mL^(-1)。壁虎处理的肝癌细胞培养形成的肿瘤球的数目和大小均缩小(P<0.05),CD44,CD133阳性的肝癌细胞比例减少(P<0.05)。守宫处理肝癌细胞后,β-catenin,CD44,c-Myc,CCND1,Sox2,Oct4,Nanog,ABCG2等表达均下调。免疫共沉淀结果显示,壁虎能抑制LRP6与Frizzled6的相互作用。表明,壁虎能够抑制肝癌细胞的增殖、肿瘤球的形成及肿瘤干细胞的比例,其通过靶向LRP6,阻止LRP6与Frizzled6复合物的形成而抑制Wnt信号通路。

癌相关成纤维细胞外泌体miR-34c-5p对胃癌细胞干细胞样表型的影响

目的探讨癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)来源的外泌体miR-34c-5p是否有助于促进胃癌(gastric carcinoma,GC)细胞的干细胞样特性。方法收集并鉴定初代培养的CAFs和配对的正常成纤维细胞(normol fibroblasts,NFs)的外泌体,检测CAFs和NFs之间外泌体中miR-34c-5p的差异表达。CCK8实验检测GC细胞活力;克隆形成实验检测GC细胞增殖能力;Transwell实验检测GC细胞侵袭能力;细胞成球形成实验评估GC细胞成球能力;蛋白质印迹法检测细胞干细胞特性相关蛋白的表达。结果miR-34c-5p在CAFs衍生的外泌体中的表达显著降低。与CAFs-exo组比较,CAFs-exo中miR-34c-5p抑制GC细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05);抑制GC细胞成球,并降低SOX2、OCT4和NANOG蛋白的表达水平,有显著性差异(P<0.05)。结论CAFs来源的外泌体miR-34c-5p抑制GC细胞的干细胞样表型。

长链非编码RNA CRNDE对胶质瘤干细胞特性改变的影响及其机制

目的探讨长链非编码RNA CRNDE对胶质瘤干细胞特性改变的影响及其机制。方法应用免疫磁珠法从人胶质瘤细胞系U251中分离出CD133+U251干细胞(U251s)。将实验细胞分为U251s组、U251s-CRNDE组及U251组、U251-CRNDE组,其中U251s-CRNDE组、U251-CRNDE组细胞预先用CRNDE短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体转染以下调CRNDE的表达。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞中CRNDE mRNA的表达水平,应用细胞计数试剂(CCK)-8法检测各组细胞的增殖变化,应用Transwell小室实验检测各组细胞的侵袭能力,应用划痕实验检测各组细胞的迁移能力,应用平板克隆实验检测各组细胞的克隆形成能力,应用流式细胞术检测各组细胞的周期改变,应用Western blotting法检测U251s组、U251s-CRNDE组细胞中干细胞标志蛋白A2B5、CD133、巢蛋白、Sox2、Oct-4、Nanog以及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路关键蛋白PI3K、AKT、磷酸化(p)-AKT、mTOR蛋白的表达水平。结果与U251组相比,U251s组细胞中CRNDE mRNA的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。U251s-CRNDE组与U251s组细胞相比,U251-CRNDE组与U251组细胞相比,前者的细胞增殖率、穿膜细胞数量、细胞迁移率、细胞集落形成数目、G2/M期细胞比例明显降低,G1/G0期细胞比例明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与U251s组相比,U251s-CRNDE组细胞中CD133、巢蛋白、Sox2、Oct-4及PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白的表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CRNDE在胶质瘤干细胞中表达增高,而下调CRNDE的表达后可以抑制胶质瘤干细胞的特性,且这种影响与PI3K-AKT-mTOR信号通路的调控有关。

微小RNA-590-5p靶向CCNG2对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-590靶向CCNG2对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响。方法选取2017年3月至2021年3月南阳市中心医院收集的59例神经胶质瘤和癌旁组织作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析分析癌旁组织和肺癌组织miR-590表达水平。神经胶质瘤细胞U251分为miRNA对照组、miR-590组和miR-590 KD组,并采用转染试剂转染对照miRNA、miR-590-5p模拟物、miR-590-5p抑制剂,48 h后检测。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和克隆形成实验分析两组细胞增殖能力;采用Transwell实验分析两组细胞的侵袭能力。采用成球实验和流式细胞术分析两组细胞的干细胞特性;采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-590靶基因。采用蛋白质印迹法(Western blot)分析细胞和肿瘤组织靶基因的表达水平。组间比较采用t检验。结果癌旁组织中miR-590-5p表达水平(1.03±0.15)明显低于神经胶质瘤组织(2.25±0.27),差异有统计学意义(t=30.640,P<0.05)。对照组细胞48 h吸光度值(2.01±0.15)明显高于miR-590-5p KD组(1.37±0.11),差异有统计学意义(t=30.640,P<0.05)。克隆形成实验结果显示,对照组细胞克隆形成数量[(81.33±10.78)个]明显高于miR-590-5p KD组[(36.67±6.71)个],差异有统计学意义(t=8.614,P<0.05)。对照组细胞侵袭数量[(122.17±15.13)个]明显高于miR-590-5p KD组[(60.17±7.83)个],差异有统计学意义(t=8.913,P<0.05)。对照组细胞SP亚群比例[(3.67±1.04)个]明显高于miR-590-5p KD组[(0.71±0.32)个],差异有统计学意义(t=6.669,P<0.05)。对照组细胞成球数量[(32.33±8.09)个]明显高于miR-590-5p KD组[(13.33±2.16)个],差异有统计学意义(t=5.557,P<0.05)。CCNG2是miR-590-5p的靶基因。对照组细胞CCNG2蛋白表达水平(0.89±0.08)明显低于miR-590-5p KD组(2.32±0.30),差异有统计学意义(t=11.130,P<0.05)。结论miR-590靶向CCNG2调节神经胶质细胞的增殖、侵袭和干细胞特性等细胞生物学行为。

干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性

背景:以CD133为标志物,利用其蛋白特异性特征可对不同的肿瘤干细胞进行分选和研究。目的:探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外增殖特性。方法:对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选,分别获得CD133^+与CD133^-MHCC97-H细胞,检测CD133表达及细胞迁移侵袭能力;培养14 d,检测细胞克隆形成率;培养7 d,检测细胞增殖及Notch基因蛋白表达。将CD133^+与CD133^-MHCC97-H细胞分别接种于裸鼠背部皮下,4周后,检测成瘤情况。结果与结论:(1)CD133表达与细胞克隆形成率:CD133^+MHCC97-H细胞CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(2)细胞增殖:CD133^+MHCC97^-H细胞培养3-7 d的吸光度值大于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(3)细胞迁移侵袭:CD133^+MHCC97-H细胞迁移与侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(4)Notch基因蛋白:CD133^+MHCC97-H细胞Notch基因蛋白表达多于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(5)成瘤实验:CD133^-MHCC97-H细胞组成瘤体积大于CD133^-MHCC97-H细胞组(P<0.05);(6)结果表明:CD133阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性,具有一定的肿瘤干细胞特性,并有较强的侵袭、转移及致瘤能力。