提高平末端连接效率的研究

在平末端连接反应中 ,为了提高连接效率 ,研究载体与片段的分子量比、载体与片段的摩尔比、连接反应体积、连接反应的温度、连接反应时间长短等条件对连接效率的影响 ,发现这些因素都会直接影响连接效率。因此在做不同的平末端连接反应时 ,应该把上述因素协同起来考虑。此外 。

“A-T”平末端连接提高目的基因片段的克隆效率

在分子生物学中，基因片段的克隆是常用技术之一。将目的片段克隆于特定的载体目前有多种策略，包括粘末端连接、粘－平末端连接以及平末端连接等。其中以粘末端的连接效率为最高，而以平末端连接效率最低。在某些情况下，由于载体缺乏可利用的限制性内切酶酶切位点，而不...

一种平末端连接的有效方法

转化效率与质粒大小成反比，而当质粒大于１５ｋｂ时，转化效率将成为限制因素，此时提高连接效率极为必要，特别是对于具有普遍性而效率又低的平末端连接。我们在连接反应体系中，加入相应的产生平末端质粒载体的限制性内切酶ＨＰａＩ、或ＥｃｏＲＶ，与不加ＨＰａＩ、或ＥｃｏＲＶ的连接反应相对照，连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９后，产生的转化子比率分别为１９．９％和５．６％（ＰＦＰ７），３２．６％和９．７％（ｐＦＢ１７５），２４．３％和３．６％（ｐＦＨ１２），３７．９％和１０．３％（ｐＦＰ２６），且从转化株中分离的质＃ＤＮＡ经电泳、酶切鉴定为目的产物。ＨｐａＩ、或ＥｃｏＲＶ的存在极有利于插入片段连接到载体上，同时抑制载体自身环化或寡聚化，大大提高了平末端连接效率。

胞液型磷脂酶A_2cDNA与载体PRCCMV连接及表达

目的 选择适当的表达载体 ,启动胞液型磷脂酶A2 (cytosolicphospholipaseA2 ,简称cPLA2 )cDNA的表达 ,为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法 从cPLA2 PMT2 重组体中获得人cPLA2cDNA片段 ,使之与酶切线性化的PRC CMV载体平末端连接 ,并转染鼠巨噬细胞 ,筛选、扩增阳性细胞 ,提取RNA ,Northern杂交法检测cPLA2 mRNA。结果 应用cPLA2 PRC CMV重组体转染鼠巨噬细胞后 ,经过North ern杂交检测到cPLA2 cDNA的表达。结论 cPLA2 PRC CMV是一有效的表达系统。

提高PCR产物及其克隆效率的几点方法与经验

本文介绍了提高ＰＣＲ产物及其克隆效率的方法与经验：如，引物的设计、目的片段的回收、连接体系、利用引物上所设计的酶切位点克隆、通过平末端克隆，以及加快实验进程的技巧、出现问题如何设计查找原因等。