SHP-2对人胃癌细胞克隆增殖的影响

目的研究SHP-2对人胃癌细胞SGC-7901细胞克隆增殖的影响。方法采用重组腺病毒Ad-GFP(GFP)、Ad-GFP-SHP-2(WT)转染SGC-7901细胞;采用蛋白印迹技术(Western blot)检测SHP-2蛋白的表达;同时进行集落形成实验检测SGC-7901细胞克隆形成能力。另外,观察SHP-2抑制剂NSC-87877作用后,对SGC-7901集落形成的影响。结果当胃癌细胞感染复数为150时,转染成功的细胞数占总细胞数的0.9。WT组SHP-2蛋白过表达。WT组的平板克隆数明显高于SGC-7901亲本细胞组(Control 1)和GFP组,P<0.05。SHP-2抑制剂组(NSC-87877)的平板克隆数及软琼脂克隆数分别明显低于SGC-7901亲本细胞组(Control2),P<0.05。结论 SHP-2对SGC-7901细胞克隆增殖有明显促进作用。

两种培养方法用于乳腺癌SK-BR-3细胞克隆形成实验的对比研究

目的观察平板克隆形成实验(PCF)和软琼脂克隆形成实验(SACF)用于乳腺癌SK-BR-3细胞学研究的价值。方法接种1×103～6×104个细胞于12.5 cm2培养瓶(设4个平行样本),分别利用PCF和SACF培养,计数形成克隆数、计算克隆形成率。结果 PCF克隆形成率为0.50%～10.64%,其中接种密度≥1.6×103/cm2者细胞间迅速汇合、难以分辨形成的克隆;SACF克隆形成率为0%～0.33%,接种密度<6.4×102/cm2者无克隆形成。PCF克隆形成率显著高于SACF(P<0.05)。结论检测SK-BR-3细胞对药物或其他治疗方式的敏感性时采用PCF优于SACF。

粉叶小檗愈伤组织单细胞克隆

以粉叶小檗愈伤组织为材料 ,用B5液体培养基进行悬浮培养建立悬浮细胞系。经 3～ 4次继代培养即可得到悬浮的单细胞。悬浮细胞通过细胞平板克隆 (一般B5培养基平板克隆 ,优化培养基平板克隆和条件培养基平板克隆 ) ,经 5代连续继代培养观察和薄板层析 -分光光度法分析 ,发现用优化培养基进行平板克隆植板率最高 ,且克隆最易成功 ,并且还筛选到一株小檗碱产率高且稳定的克隆CV 5 7,其平均生长速率为 14 .4 12mg .Fw/L .d ,为原始株系的 1.91倍 ,平均小檗碱含量为 2 .17%干重 ,是原始株系的 2 .2 6倍。

粉叶小檗愈伤组织单细胞克隆

以粉叶小檗愈伤组织为材料,用B5液体培养基进行悬浮培养建立悬浮细胞系。经3～4次继代培养即可得到悬浮的单细胞。悬浮细胞通过细胞平板克隆(一般B5培养基平板克隆、优化培养基平板克隆和条件培养基平板克隆),经5代连续继代培养观察和薄板层析-分光光度法分析,发现用优化培养基进行平板克隆植板率最高,且克隆最易成功,并且还筛选到一株小檗碱产率高且稳定的克隆CV-57,其平均生长速率为每天14.412mg/L,为原始株系的1.91倍,平均小檗碱含量为干重的2.17%,是原始株系的2.26倍。

中国野生蓝莓总花青素对A549细胞活力和周期改变的影响

为了进一步探究中国野生蓝莓的功能特性,本研究从中国野生蓝莓中提取总花青素,并使用XAD-7大孔树脂进行纯化,考察纯化后总花青素提取物对A549细胞平板克隆、增殖、细胞周期、早期凋亡和ROS释放的影响,并初步探讨其作用机理。研究结果表明,中国野生蓝莓总花青素对A549细胞活力有明显的抑制作用,对其增殖抑制的IC50值为176.652μg/m L,对细胞周期也有明显影响并能引起早期凋亡现象以及ROS释放。

肿瘤细胞放射敏感性与放射诱导凋亡关系的研究

目的探讨肿瘤细胞放射敏感性与放射诱导凋亡的关系。方法使用^(60)Coγ射线对人小细胞型肺癌细胞株(NCI-H446)和人宫颈鳞癌细胞株(Siha)和人胃癌细胞株(SGC-7901)进行照射,采用克隆形成实验拟合细胞存活曲线,根据Do值、Dq值等放射生物学参数,比较肿瘤细胞的放射敏感性。琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡,透射电镜观察凋亡特有的形态,流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率,分析3种肿瘤细胞的凋亡率与放射敏感性的关系。结果3种肿瘤细胞Do值的大小依次为NCI-H446<Siha<SGC-7901,Dq值大小依次为NCI-H446<Siha<SGC-7901,放射敏感性的高低依次是NCI-H446>Siha>SGC-7901。琼脂糖凝胶电泳能够观察到细胞凋亡的特有梯状条带(DNALadder),电镜能够观察到凋亡的特有的形态,如细胞核固缩、染色质浓缩、凋亡小体形成等,流式细胞仪检测到明显的凋亡峰。肿瘤细胞凋亡率随着照射剂量的增加而增高,呈良好的剂量-效应关系,并且3种肿瘤细胞株凋亡峰值的大小依次为NCI-H446>Siha>SGC-7901,与其放射敏感性高低一致。结论放射线能够诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡率随着照射剂量的增加而增高。放射诱导的肿瘤细胞凋亡率越高,则其放射敏感性越高。肿瘤细胞凋亡率的检测对预测其放射敏感性有一定的价值。

胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中及血管形成中的作用和机制

背景:肿瘤干细胞及其分化的血管细胞对于化疗、分子靶向治疗并不敏感,虽然能够减少肿瘤总体的血供,却助长了肿瘤的浸入及转移,成为治疗失败的主要机制。目的:分析胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中的机制及其在血管形成中的作用。方法:取20株胃癌肿瘤干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901细胞,普通癌细胞培养条件为10%的PBS;肿瘤干细胞CSC-G培养条件为:DMEM/F12(1∶1)、B27(2%)、表皮生长因子(20μg/L)。对2种细胞进行球形克隆形成试验、平板克隆试验以及Transwell侵袭性实验,观察胃癌肿瘤干细胞的侵袭性;测定CD44、E-cadherin中mR NA水平及蛋白表达水平,观察细胞的转移能力;利用细胞划痕试验、Transwell迁移实验和成环实验观察细胞的血管形成能力。结果与结论:(1)普通癌细胞均贴壁生长,肿瘤干细胞CSC-G为悬浮生长,生长后显微镜下显示为梭形间质形态;(2)球形克隆形成试验结果:普通癌细胞瘤球数量显著少于肿瘤干细胞CSC-G(P<0.05);(3)平克隆试验结果:胃癌肿瘤干细胞瘤球数量显著多余普通胃癌细胞(P<0.05);(4)转移性试验结果:胃癌肿瘤干细胞穿过基底膜细胞数显著多于普通胃癌(P<0.05);(5)划痕试验结果:肿瘤干细胞CSC-G迁移距离、成环试验中成环数量显著多于普通胃癌细胞(P<0.05)。(6)结果提示:胃癌肿瘤干细胞侵袭能力高于普通胃癌细胞,且胃癌干细胞迁移能力以及血管成形能力较强,它可以通过形成血管等途径来进一步促进胃癌的发生与发展。

白花蛇舌草石油醚部位对子宫内膜癌细胞的抑制作用

目的:探究白花蛇舌草石油醚部位体外对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用及机制。方法:白花蛇舌草石油醚部位处理子宫内膜癌Ishikawa细胞株,倒置相差显微镜观察细胞生长状态;MTT法检测细胞存活率;平板克隆形成实验检测癌细胞克隆形成能力;PI染色,流式细胞仪检测细胞周期。结果:白花蛇舌草石油醚部位对体外培养的人子宫内膜癌细胞具有明显的细胞毒性,其IC50值为32.917μg·m L-1。该药物显著抑制Ishikawa细胞增殖以及细胞的克隆形成能力,而且作用效果具有明显的剂量依赖效应。该部位可使细胞周期阻滞在G1期。结论:白花蛇舌草石油醚部位体外抗人子宫内膜癌活性显著,可能为该中药材发挥抗癌作用的主要活性成分,其机制可能与阻滞细胞周期的进展有关。

Cdc20基因突变对APC^(min/+)小鼠胚胎成纤维细胞生长的影响

目的观察Cdc20AAA/+APCmin/+基因型小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的生物学性状,探讨Cdc20基因突变对MEFs生长的影响及机制。方法制作Cdc20AAA/+APCmin/+基因型、Cdc20AAA/+基因型、APCmin/+基因型和野生型(WT)小鼠胚胎成纤维细胞,绘制生长曲线、进行平板克隆形成实验,比较各种基因型MEFs生长特性的改变。各种基因型MEFs核型分析染色体个数,并检测有丝分裂姐妹染色单体分离情况及是否存在染色体不稳定。结果 Cdc20AAA/+APCmin/+基因型MEFs生长速度快于APCmin/+基因型(P<0.01)。Cdc20AAA/+APCmin/+基因型MEFs克隆形成能力明显增强。Cdc20AAA/+APCmin/+MEFs中可见姐妹染色单体的提前分离,且染色体数目异常要多于APCmin/+MEFs,大多数为38对。结论 Cdc20AAA/+基因突变促进APCmin/+小鼠胚胎成纤维细胞生长及增殖,使其呈现肿瘤细胞的生长特性,其机制可能与染色体不稳定有关。

RNAi抑制CAR基因对人肺鳞癌细胞系NCI-H520裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的:建立RNAi抑制柯萨奇病毒腺病毒受体(coxsackievirus and adenovirus receptor,CAR)基因表达的肺鳞状细胞癌NCI-H520稳定表达细胞系,将CAR基因沉默的NCI-H520细胞移植于裸鼠体内构建移植瘤模型,观察裸鼠体内成瘤率及对瘤体生长等方面的影响。方法:将针对CAR mRNA序列设计的小干扰RNA重组质粒分别以脂质体转染至NCI-H520细胞,并经G418抗性筛选得到稳定细胞系;用平板克隆形成实验观察RNAi抑制CAR基因表达对NCI-H520细胞增殖的影响;通过动态观察瘤体的生长,进一步验证CAR对肺癌的增殖是否有促进作用。结果:筛选出抑制CAR基因表达效果最佳的一组shRNA,并建立了能稳定而有效抑制CAR基因表达的肺鳞癌NCI-H520细胞系。平板克隆形成实验显示,shRNA-2抑制CAR基因表达后NCI-H520细胞的增殖能力有所下降,但其差异无统计学意义(P>0.05);且在肿瘤形成实验中,实验组瘤重显著低于对照组(P<0.01)。结论:裸鼠肺癌移植瘤模型构建成功,为今后肺癌的研究奠定基础。利用RNAi有效抑制了CAR基因的表达,并抑制NCI-H520细胞在裸鼠体内瘤体的生长,CAR有望成为肺癌基因治疗的靶点之一。

三株人肺癌细胞放射敏感性体外研究

目的通过体外实验探讨三株人肺癌细胞的放射敏感性。方法使用60钴γ射线对人小细胞型肺癌细胞株(NCI-H446)和人肺鳞癌细胞株(SK-MES-1)和人肺腺癌细胞株(Lu-165)进行照射,采用克隆形成实验拟合细胞存活曲线,根据D0、Dq、N及SF2值等放射生物学参数,比较肿瘤细胞的放射敏感性。流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率,分析3种肿瘤细胞的凋亡率与放射敏感性之间的关系。结果3种肿瘤细胞D0、Dq、N及SF2值大小依次为NCI-H446<SK-MES-1<Lu-165,放射敏感性依次为NCI-H446>SK-MES-1>Lu-165。流式细胞仪检测到明显的凋亡峰,肿瘤细胞凋亡率随着照射剂量的增加而增加,并且3种肿瘤细胞株凋亡峰值依次为NCI-H446>SK-MES-1>Lu-165,与其放射敏感性高低一致。结论肿瘤细胞凋亡率的检测对预测其放射敏感性有一定的价值。

半枝莲体外抗子宫内膜癌活性的研究

目的:研究半枝莲不同极性部位体外抗子宫内膜癌细胞Ishikawa的活性作用。方法:采用MTT法检测半枝莲不同极性部位对子宫内膜癌细胞Ishikawa的增殖抑制作用;采用平板克隆形成实验检测活性最强部位对Ishikawa细胞克隆形成能力的影响;应用流式细胞仪检测活性最强部位对Ishikawa细胞周期分布的影响。结果:半枝莲不同极性部位对子宫内膜癌细胞Ishikawa均有不同程度的抑制作用,其中氯仿部位的抑制作用最强(IC50=146.494μg/ml)。随着供试药物浓度的升高,细胞克隆形成能力降低;半枝莲氯仿部位对Ishikawa细胞表现为S期、G2/M期阻滞作用。结论:半枝莲氯仿部位是半枝莲抗子宫内膜癌细胞Ishikawa的最主要有效部位。

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表达可促进NIH3T3细胞增殖

目的研究外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(ex JSRV Env)对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖的影响。方法构建含完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(ex ISRV-env)的重组质粒pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env,并鉴定其正确性。采用脂质体转染技术pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env瞬时转染NIH3T3细胞,利用反转录PCR和Western blot法检测Env的表达,利用CCK-8法和平板克隆形成实验检测Env表达对NIH3T3细胞增殖的影响。结果成功构建了含ex JSRV-env的重组真核表达质粒pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env;以重组质粒瞬时转染NIH3 T3细胞,检测到JSRV Env蛋白的表达,CCK-8法和平板克隆形成实验结果表明转染pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env的细胞增殖速度显著高于对照组(空白及阴性)细胞。结论 NIH3T3细胞表达的JSRV Env蛋白可促进NIH3 T3细胞的增殖。

Pokemon基因对MCF-7细胞增殖的影响

目的转染Pokemon表达载体到MCF-7细胞中,探究Pokemon对乳腺癌细胞增殖的影响。方法构建Pokemon基因表达质粒,瞬时转染Pokemon表达质粒到乳腺癌细胞中,Western blot检测pokemon的蛋白水平表达情况,通过MTT和平板克隆形成试验法观察Pokemon对乳腺癌细胞增殖及克隆形成能力的影响。结果MTT法显示,随着培养时间的增加,MCF-7细胞在转染Pokemon后的生长速度明显增加;细胞平板克隆形成试验显示,MCF-7细胞在转染Pokemon后克隆数明显增加,由此可以说明Pokemon能增强癌细胞MCF-7克隆形成能力。结论Pokemon作为一个致癌基因,能促进乳腺癌MCF-7细胞系的增殖并增加其克隆形成能力。

三氧化二砷对胃癌细胞放射增敏作用的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)是否对胃癌细胞有放射增敏作用。方法以人胃癌细胞株SGC-7901为研究对象,所有实验均重复3次,取其均值为最终结果。①四甲基四氮唑盐比色法(MTT法)检测As2O3的单药毒性,确立细胞半数抑制浓度(IC50),并行单纯照射组及As2O3+照射组MTT检测,计算q值大小。②放射增敏实验分成空白对照组、单纯给药组、单纯照射组及As2O3+照射组,采用平板克隆形成分析法计算各组细胞存活分数(SF),运用"多靶单击数学模型"拟合细胞存活曲线,得出平均致死剂量(Do)、准阈剂量(Dq)、放射增敏比(SER),并观察单纯照射组及As2O3+照射组对肿瘤细胞的杀伤作用。结果胃癌细胞株SGC-7901细胞IC50值为12.65μmol/L,与单纯照射组及单纯给药组相比,As2O3与放射治疗联合作用能显著抑制SGC-7901细胞的增殖,并显示出As2O3与放射治疗的协同作用(q>1.15)。单纯照射组Do、Dq分别为2.75、2.52Gy,2μmol/LAs2O3+照射组Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分别为2.18Gy、1.89Gy、1.26、1.33,5μmol/LAs2O3+照射组Do、Dq、SER(Do值比)、SER(Dq值比)分别为1.78Gy、1.72Gy、1.54、1.51。结论As2O3对人胃癌细胞株SGC-7901有一定的放射增敏作用,为临床放疗及与As2O3联合运用提供了实验依据。

卡波氏肉瘤病毒编码的miR-K7-3p重组慢病毒载体构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的:构建卡波氏肉瘤病毒(KSHV)编码的miR-K7-3p的重组慢病毒载体,并检测其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖能力的影响。方法:将miR-K7-3p的序列及互补序列插入miR-30茎环结构,以此为模板扩增出目的片段,插入慢病毒载体mp CDH-CMV-MCS-EF1-tRFP(简写为mp CDH,tRFP基因可表达红色荧光蛋白)中,构建重组慢病毒载体mp CDH-miR-K7-3p。将构建的目的质粒mp CDH-K7-3p与包装质粒ps PAX2、包膜质粒p MD2.G共同转染人胚肾上皮细胞(293 T),包装表达miR-K7-3p的慢病毒。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。用包装成功的miR-K7-3p慢病毒感染HUVECs,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-K7-3p的表达,CCK-8及平板克隆实验检测细胞增殖力。结果:双酶切鉴定、核酸序列测定与比对结果证实重组慢病毒质粒mp CDH-miR-K7-3p构建成功。qRT-PCR检测到重组慢病毒感染的HUVECs中miR-K7-3p的表达水平升高。增殖实验结果显示,miR-K7-3p慢病毒感染后的HUVECs增殖能力明显强于对照组。结论:miR-K7-3p可以明显促进HUVECs的增殖。

一种分离人表皮角质形成细胞的新方法

目的:探索一种简单快速无需分开表皮和真皮即可分离得到人表皮角质形成细胞(KC)并进行体外培养的方法。方法:取皮肤组织切碎后,先用含分散酶和Ⅰ型胶原酶的消化液37℃浸泡60 min,然后加入胰酶消化30 min,再加入DNA酶继续消化5 min以获得单个细胞;加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中和消化,用100μm细胞过滤器过滤,离心后,用含10 mmol/L Rock蛋白激酶抑制剂的DMEM培养基(含10%FBS)培养,3 d后换成Cn T07培养基。每2 d换液1次,培养过程中,观察细胞生长状态。结果:与传统分散酶分离表皮KC方法相比,用该方法分离得到的表皮KC数量较多,第1代以克隆形式生长并且生长较快;传代后细胞呈角质细胞形态,主要表达未分化的角质蛋白K5,生长曲线和形成单细胞克隆能力和传统分离的表皮KC相近,并稍优于传统方法。采用新方法成功地从带毛发的头皮组织分离出大量的表皮KC并表达正常的角质蛋白。结论:该法得到的表皮KC形态、生长状态及形成单克隆的能力都接近或优于传统方法。该方法简单高效,具有较高的实用价值,尤其为以后临床上大量分离患者的表皮KC用于细胞治疗奠定基础。

胃腺癌组织中circ-104533的表达情况及其对胃癌细胞生长增殖的影响

目的探讨胃腺癌组织中环状RNA-104533(circ-104533)的表达情况及对其对胃癌细胞生长增殖的影响。方法通过circRNA芯片得出在胃癌中有统计学差异的11个高表达circRNA,然后经过qRT-PCR实验在78例胃腺癌组织中进行验证,仅得出circ-104533和circ-102712呈现高表达水平。本研究以circ-104533为研究对象,分析胃腺癌组织中circ-104533表达水平与临床病理特征的相关性。通过体外细胞转染技术建立过表达circ-104533和敲低表达circ-104533表达的胃癌SGC-7901细胞株,采用CCK-8法和平板克隆实验检测胃癌细胞的生长和增殖能力。结果胃腺癌组织中circ-104533的表达水平高于癌旁正常组织(P<0.05)。根据circ-104533表达水平将胃腺癌组织标本分为正常/低表达组(19例)和高表达组(59例)。circ-104533表达水平与肿瘤大小和分化程度密切相关(P<0.05),而与患者年龄、性别、肠化、病理类型、淋巴结转移和TNM分期无相关性(P>0.05)。体外细胞实验表明,过表达circ-104533后癌细胞72 h OD值和克隆形成数大于正常癌细胞组(P<0.05),而敲低表达circ-104533后癌细胞72 h OD值和克隆形成数小于正常癌细胞组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论胃腺癌组织中circ-104533表达水平升高,其可能是胃腺癌一种新的促癌基因;circ-104533能促进胃腺癌的发生发展过程。

LncRNA AC006449.2抑制卵巢癌细胞增殖

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一类无蛋白质编码功能的RNAs。多项研究表明,lncRNAs在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。GEPIA数据库结合qRT-PCR结果提示,lncRNA AC006449.2在卵巢癌组织中的表达量显著低于正常组织,且其在卵巢癌细胞中的水平也低于正常卵巢上皮细胞。进一步分析发现,lncRNA AC006449.2的表达量与卵巢癌患者较差的预后负相关,与瘤体大小和远端转移密切相关,而与卵巢癌患者年龄、淋巴结转移及TNM分期无关。细胞功能研究发现,上调AC006449.2,卵巢癌细胞的增殖和平板克隆能力降低;而下调AC006449.2之后,该细胞的增殖和平板克隆能力显著增加。深入的机制研究发现,AC006449.2可上调细胞周期相关蛋白p21和p27的表达量,上调促凋亡蛋白Bax的表达,而下调抗凋亡蛋白Bcl2的表达量,最终抑制卵巢癌细胞的增殖。上述研究结果推测,lncRNA AC006449.2在卵巢癌细胞中可能发挥抑癌因子的作用。