雌激素上调体外培养的子宫肌瘤平滑细胞中原纤维蛋白-1的表达

目的探讨卵巢激素是否影响体外培养的子宫肌瘤平滑肌细胞中(Fibrillin-1,FBN-1)mR-NA和蛋白的表达。方法10份子宫肌瘤及同源正常子宫平滑肌组织标本在术中被采集,游离的子宫肌瘤平滑肌细胞及同源正常子宫平滑肌细胞在含有10%的胎牛血清DMEM培养基中培养。在细胞达到70%融合时继续用无血清培养基培养48h,然后加入递增剂量的17β雌二醇(17-βestrodioal,E2)(0、0.1、1、10ng/ml)或E210ng/ml联合加入递增剂量的孕激素(0、1、10、100ng/ml)继续培养48h。采用实时荧光定量PCR、Western blot及荧光免疫组织化学方法探查FBN-1 mRNA和蛋白在体外培养的子宫肌瘤平滑肌细胞中的表达。结果免疫荧光组织化学染色显示FBN-1在子宫肌瘤平滑细胞及正常子宫平滑肌细胞中均有表达;E2呈剂量依赖性增加子宫肌瘤平滑细胞中FBN-1 mRNA和蛋白的表达,尤其在E2浓度增加为10ng/ml时,与对照组相比差异显著(P<0.05,P<0.01);而在E2联合不同剂量的孕激素的情况下对子宫平滑肌瘤细胞FBN-1 mRNA和蛋白表达无影响。结论雌激素增加体外培养的子宫肌瘤平滑细胞中FBN-1 mRNA和蛋白的表达。

压力负荷下大鼠主动脉平滑细胞fos基因表达

压力负荷下大鼠主动脉平滑细胞ｆｏｓ基因表达张放鸣，何光篪，刘正津第三军医大学重庆６３００３８以（３５）Ｓ标记的ｃ－ｆｏｓ为探针用原位杂交的方法研究压力负荷下大鼠主动脉平滑肌的基因表达，在分子水平探讨力对平滑肌细胞增殖的影响。实验结果表明：正常情况下，...

雷帕霉素对葡萄糖诱导SD大鼠阴茎海绵体平滑细胞自噬与凋亡的影响

目的:观察雷帕霉素对葡萄糖诱导SD大鼠阴茎海绵体平滑细胞(CCSMC)自噬与凋亡的影响。方法:原代分离纯化鉴定CCSMC后分别用5.6、10、20、30、40 mmol/L葡萄糖处理CCSMC 48 h,mCherry-GFP-LC3B双荧光腺病毒转染细胞检测自噬流情况;Western印迹及PCR检测自噬相关指标、自噬相关基因5(ATG5)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62、Beclin-1的蛋白和mRNA水平的变化;流式细胞术检测不同浓度葡萄糖处理后细胞凋亡情况,然后再检测用600 nmol/L雷帕霉素预处理2 h再用40 mmol/L葡萄糖处理CCSMC 48 h后自噬相关指标LC3、Beclin1、P62的蛋白和mRNA水平的变化以及细胞凋亡的变化情况。结果:mCherry-GFP-LC3B双荧光腺病毒转染及PCR、Western印迹均提示在不同浓度葡萄糖处理后均发生了自噬现象,随着葡萄糖浓度升高,在10 mmol/L葡萄糖组自噬现象最强(P<0.05),之后随着葡萄糖浓度升高自噬现象逐渐减弱(P<0.05);流式细胞术检测发现相对于5.6 mmol/L葡萄糖组,10 mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率无显著升高(P=0.302),但随着葡萄糖浓度升高,细胞凋亡率逐渐升高(P<0.01)。给予雷帕霉素预处理后,Western印迹及PCR检测均提示LC3的蛋白表达量,Beclin1的蛋白和mRNA表达量增多(P<0.05),而P62的蛋白和mRNA表达量降低(P<0.05),表明自噬增强。细胞凋亡率在雷帕霉素预处理后也显著降低(P<0.01)。结论:当不同浓度葡萄糖体外培养CCSMC,葡萄糖浓度在一定范围内时可能促进自噬,从而对CCSMC起到保护作用,但葡萄糖浓度超过一定浓度后,可能超过了CCSMC承受的范围,出现自噬降低,促进细胞凋亡,从而损害细胞活力和功能。而高浓度葡萄糖作用于CCSMC,雷帕霉素可能通过增强自噬,抑制细胞凋亡水平,从而对CCSMC起到保护作用。

机械应力调控血管平滑肌细胞的凋亡

背景:随着生物力学的发展,其在心血管疾病中的研究也日益广泛,通过研究血管的力学特性可以有效地揭示动脉粥样硬化、再狭窄等心血管疾病的发病机制,开发心血管疾病治疗的新思路和新方法。目的:综述机械应力刺激对血管平滑肌细胞凋亡的研究现状,寻找临床治疗潜在靶分子和信号通路,以期改善临床动脉粥样硬化及再狭窄等心血管疾病的临床治疗效果。方法:检索1992年1月至2023年5月在中国知网、PubMed及ScienceDirect数据库收录的文献。中文检索词为“血管平滑肌细胞,机械应力,剪切力,牵张力,凋亡”;英文检索词为“vascular smooth muscle cell,mechanical stress,shear stress,stretch stress,apoptosis”,最终纳入63篇文献进行综述分析。结果与结论:①血管平滑肌细胞的生理性和病理性凋亡都是为了适应血管力学变化而发生的适应性重构。不同部位的平滑肌细胞承受不同的力学刺激,其发病机制也不同。②低剪切力、生理剪切力和高剪切力可通过直接与平滑肌细胞表面分子、受体及蛋白等作用调控凋亡信号分子和抑制增殖实现对血管平滑肌细胞凋亡的调控,该部分未对促进增殖的研究进行综述。③低牵张力、生理牵张力和高牵张力可导致平滑肌细胞凋亡,但仍存在争议。平滑肌表面存在多种力学感受分子(如整合素及受体络氨酸激酶等)可以将力学信号转导为细胞内的化学信号(如Hippo通路),启动平滑肌细胞的凋亡信号,调控平滑肌细胞的凋亡。④总之,不同力学刺激通过多种信号分子,启动多个信号通路共同作用,调控平滑肌细胞的凋亡,例如剪切力主要通过刺激分泌前列腺素、转化生长因子等影响Fas/FasL、Akt通路;而牵张力主要通过Yes相关蛋白等调控YAP通路和Notch通路等。这些分子在不同的作用时间,或不同作用强度下可能发挥相反的双向作用,比如,小鼠血管平滑肌细胞受到10%生理牵张1 h时,其增殖增加;然而,人的血管平滑肌细胞牵张12 h后可以减少其增殖。临床可以通过寻找其关键作用时间点干扰力学转导关键分子,达到预防和治疗临床心血管疾病的目的。

人尿源性干细胞的分离培养及诱导分化为平滑肌细胞

背景:传统尿路修复重建手段受限于供体短缺、并发症多以及生理功能恢复不理想等问题,组织工程策略为此领域提供了新方向。鉴于尿路主要由肌性组织构成,其中关键在于发掘适合的种子细胞并高效诱导分化为平滑肌细胞,但关于不同平滑肌细胞诱导方案效能的对比研究仍较为匮乏。目的:旨在分离、培养及鉴定人尿源性干细胞,并比较两种不同成平滑肌诱导方案的效果。方法:采用多次离心法从11份健康成人志愿者尿液中分离提取尿源性干细胞,使用流式细胞仪进行表面标志物的鉴定,通过成骨、成脂诱导分化来验证尿源性干细胞的多向分化潜能。尿源性干细胞分别在含转化生长因子β1以及转化生长因子β1联合血小板衍生生长因子的成平滑肌细胞诱导分化培养基中诱导分化14 d,采用免疫荧光染色和Western blot检测平滑肌特异性蛋白(α-SMA、SM22)的表达差异。结果与结论:①成功从8份健康人尿液中分离出尿源性干细胞,细胞呈“米粒”样,具有很好的分裂增殖能力;②尿源性干细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90和CD44,极低表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45,不表达CD19、CD105和HLA-DR;③经成骨和成脂诱导分化后,可见明显的钙结节和脂滴形成,茜素红染色和油红O染色结果呈阳性;④成平滑肌诱导培养14 d,免疫荧光染色显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组尿源性干细胞成平滑肌诱导分化率显著高于转化生长因子β1组(P<0.005);⑤成平滑肌诱导培养14 d,Western blot检测显示转化生长因子β1/血小板衍生生长因子组α-SMA和SM22蛋白表达量显著高于转化生长因子β1组(P<0.005)。结果表明:尿源性干细胞可以通过多次离心法无创分离获取;相较于单纯转化生长因子β1,转化生长因子β1/血小板衍生生长因子联合应用能显著提高尿源性干细胞诱导分化为平滑肌细胞的效率。

炎性因子干扰素γ以焦亡途径影响人血管平滑肌细胞的迁移和凋亡

背景:子宫螺旋动脉重铸的顺利进行是正常妊娠的必要条件之一,血管平滑肌细胞是此过程的重要细胞。干扰素γ与妊娠早期螺旋动脉血管平滑肌细胞丢失相关,但具体机制尚未明确。目的:探讨干扰素γ通过NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径对血管平滑肌细胞迁移、凋亡生物学功能的影响。方法:人血管平滑肌细胞分为对照组和干扰素γ组,对照组正常培养,干扰素γ组采用10 ng/mL干扰素γ处理24 h。Transwell实验检测血管平滑肌细胞的迁移能力;荧光TUNEL实验及流式细胞术检测血管平滑肌细胞的凋亡情况;qPCR检测NLRP3和caspase-1 mRNA表达水平;Western blot检测NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD蛋白表达水平。结果与结论:与对照组相比,干扰素γ组血管平滑肌细胞的迁移能力及凋亡率显著升高(P<0.05);与对照组相比,干扰素γ组血管平滑肌细胞中NLRP3和caspase-1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与对照组相比,干扰素γ组血管平滑肌细胞中NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结果表明,干扰素γ可能通过NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径调控血管平滑肌细胞的迁移和凋亡。

血栓心脉宁片通过调控TGF-β_(1)和Runx2表达抑制血管平滑肌细胞钙化的研究

目的探讨血栓心脉宁片是否可通过调控转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))和Runt相关转录因子2(Runx2)表达抑制血管平滑肌细胞的钙化。方法取对数生长期大鼠血管平滑肌细胞,实验分为5组:阴性组细胞加入DMEM培养液培养;钙化组加入β-磷酸甘油(β-GP)作用24 h诱导血管平滑肌细胞钙化;血栓心脉宁低、中、高剂量组先分别加入125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L的血栓心脉宁片培养24 h后再给予β-GP作用24 h。采用CCK-8法检测各组细胞活力,酶标仪检测各组细胞中钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性及TGF-β_(1)含量,Western blot法检测细胞中Runx2蛋白表达情况。结果与阴性组比较,钙化组细胞活力明显下降(P<0.05),细胞中钙含量、ALP活性、TGF-β_(1)含量及Runx2蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与钙化组比较,血栓心脉宁各组细胞活力均明显提高(P均<0.05),细胞中钙含量、ALP活性、TGF-β_(1)含量及Runx2蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),且各指标均呈浓度依赖性变化。结论血栓心脉宁片可能通过调控TGF-β_(1)和Runx2的表达,抑制大鼠血管平滑肌细胞的钙化。

高磷诱导下肢血管平滑肌细胞成骨分化关键差异表达基因筛选及验证

目的:采用mRNA高通量测序技术筛选高磷诱导下肢血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化差异表达基因(DEGs),分析VSMCs钙化的关键基因及信号通路。方法:将人VSMCs分为对照组和模型组,模型组细胞中加入高磷培养基,对照组细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基于相同条件下培养。调整2组稳定转染VSMCs的状态,培养12 d,倒置显微镜下观察细胞形态表现并拍照。采用Hisat2软件筛选DEGs,采用Stringtie软件从生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)3个方面进行基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。Von Kossa染色法观察各组细胞钙化情况,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组细胞中碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肿瘤蛋白53(Tp53)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白轻链1(Ftl1)和糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1(GPLD1)mRNA表达水平。结果:与对照组比较,模型组共2 524个DEGs,其中1 368个DEGs表达上调,1 156个DEGs表达下调;2组细胞DEGs聚类分离明显。GO功能和KEGG信号通路富集分析表达上调的DEGs主要参与微管细胞骨架组织的调节、细胞极性、蛋白质定位和细胞周期调控等BP,构建细胞膜部分、微管组织、染色体和着丝粒区等CC,发挥与磷脂酰肌醇磷酸盐、 Rho鸟苷酸三磷酸酶(GTPase)蛋白结合、参与跨膜转运和调节蛋白激酶活性等MF;表达下调的DEGs主要参与细胞质翻译、蛋白质膜定位、mRNA代谢和蛋白质内质网定位等BP,构建核糖体亚单位、细胞膜和自噬体等CC,发挥与单链DNA、核糖核蛋白复合物、生长因子结合、调节蛋白激酶活性和催化作用等MF。差异表达上调的基因富集7条信号通路,其中最为显著的是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的生物合成;差异表达下调的基因富集18条信号通路,其中最为显著的是铁死亡。RT-qPCR法,与对照组比较,模型组细胞中GPX4、Ftl1和Tp53 mRNA表达水平明显降低(P<0.01),GPLD1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与对照组比较,模型组细胞中α-SMA mRNA表达水平明显降低(P<0.01),ALP和BMP2 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。结论:钙化的VSMCs与正常细胞存在DEGs,铁死亡和GPI锚定的生物合成信号途径是高磷诱导下肢VSMCs钙化的关键信号通路,主要由GPX4、Ftl1、Tp53和GPLD1共同介导完成。

机械通气相关高拉伸通过miRNA-mRNA相互作用调节气道平滑肌细胞嘌呤代谢影响细胞刚度

目的机械通气为呼吸危重症患者提供生命支持,但也引起肺损伤(VILI),后者因病理机制不明一直是呼吸与危重症学科的重大难题。气道平滑肌细胞(ASMC)是气道内对拉伸极为敏感细胞,但ASMC在VILI中的作用及其机制尚不清楚。本研究结合全基因组测序、生物力学和细胞分子生物学相关方法,在机械通气相关高拉伸条件下分析ASMC对机械通气的主要响应机制及力学调控作用。方法采用Flexcell-5000在体外高拉伸(13%)处理人ASMC,全基因组测序分析细胞mi RNA和m RNA表达并进行mi RNA-m RNA生物信息学的整合分析,光学磁微粒扭转系统、牵张力显微术分析细胞力学特性。结果全基因组学mi RNA-m RNA整合分析发现机械通气相关高拉伸主要通过影响mi RNA-m RNA相互作用调节ASMC嘌呤代谢,如通过mi R-370-5p(↓)-PDE4D/AK7(↑)调节ATP、c AMP合成;体外细胞水平研究发现高拉伸调节ASMC内的c AMP/ATP并改变ASMC细胞刚度,且可以被mi R-370-5p模拟物部分逆转。结论本研究揭示了机械通气相关高拉伸(>10%应变)通过调控mi RNA-m RNA网络调节ASMC力学行为从而影响肺功能,为VILI的生物标志物筛选及新型治疗靶点提供新见解。

冠脉搭桥术后静脉桥平滑肌细胞模型建立

目的探索冠脉搭桥静脉桥体外细胞模型的建立。方法体外培养大鼠静脉平滑肌细胞,正常对照组,5%张应力组,10%张应力组,15%张应力组4组,细胞拉伸装置不同拉伸幅度拉伸细胞,观察细胞形态变化,CCK-8检测观察细胞活性变化,Edu染色观察细胞增殖变化,划痕实验观察细胞迁移能力变化。结果与正常对照组相比较,5%张应力对细胞活度无显著影响(P>0.05);10%张应力明显促进细胞活力(P<0.05);而15%张应力则明显抑制细胞活力(P<0.01)。与正常对照组相比,5%张应力对细胞增殖无显著影响(P>0.05);10%张应力明显促进细胞增殖(P<0.01);15%张应力明显抑制细胞增殖(P<0.05)。与正常组对比,5%张应力对细胞迁移能力无明显影响(P>0.05);10%张应力促进细胞迁移能力(P<0.05);15%张应力明显抑制细胞迁移能力(P<0.05)。结论建立模型在频率1HZ,拉伸变形幅度10%参数设定下,血管平滑肌细胞与临床静脉桥再狭窄增生细胞生物行为表现一致。

白桦脂酸通过RRAGD/mTOR/ULK1促进自噬改善血管平滑肌细胞钙化

目的 探讨白桦脂酸(Betulinic acid, BA)对高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的作用机制。方法 采用2.6μmol·g^(-1)高磷诱导小鼠主动脉平滑肌细胞体外钙化模型,CCK8检测白桦脂酸对细胞活力的影响;加入白桦脂酸低、中、高剂量(5μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1))及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5μmol·g^(-1))。慢病毒过表达Ras相关GTP结合蛋白D(Ras-related GTP-binding Protein D,RRAGD)转染血管平滑肌细胞,通过荧光显微镜、RT-PCR验证转染效率。采用茜素红染色、细胞内钙含量、碱性磷酸酶活性检测细胞钙化程度;Western blot检测血管平滑肌细胞钙化指标RUNT相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein, BMP2),平滑肌蛋白22α(Smooth muscle protein 22α,SM22α)和平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA);UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1),自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ),泛素结合蛋白P62(P62),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)以及RRAGD的表达。结果 根据CCK8细胞活力结果选择白桦脂酸5、10、20μmol·L^(-1)剂量进行后续实验;钙水平、碱性磷酸酶活性及茜素红染色实验结果显示白桦脂酸改善高磷诱导血管平滑肌细胞钙化;Western blot结果显示白桦脂酸下调RUNX2、BMP2、RRAGD、p-mTOR、P62(P<0.05),上调SM22α、α-SMA、LC3Ⅱ/Ⅰ、p-ULK1的蛋白表达(P<0.05)。白桦脂酸减轻高磷诱导血管平滑肌细胞钙化的作用被自噬抑制剂3-MA和过表达RRAGD阻断。结论 白桦脂酸可能通过RRAGD/mTOR/ULK1信号通路促进自噬抑制血管平滑肌细胞钙化。

氯沙坦通过IRE1-TRAF2-ASK1-JNK信号通路调节高糖诱导的血管平滑肌细胞的增殖、凋亡和迁移

目的 探讨氯沙坦(LT)通过肌醇需求酶(IRE)1-肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)2-凋亡信号调节激酶(ASK)1-c-Jun N末端激酶(JNK)信号通路对高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、凋亡和迁移的影响。方法 取对数生长期VSMCs,并分组为空白组、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、高糖+LT组(25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L LT)、高糖+毒胡萝卜素(TG)组(25 mmol/L葡萄糖+0.2 nmol/L IRE1α激动剂TG)、高糖+LT+TG组(25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L LT+0.2 nmol/L TG)。流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell及划痕实验检测细胞迁移;细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测细胞增殖;Western印迹检测IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路相关蛋白表达水平。结果 与空白组相比,高糖组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著增加(P<0.05);与高糖组相比,高糖+LT组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著降低,细胞凋亡率显著增加(P<0.05),但高糖+TG组VSMCs迁移率、增殖率、IRE1、TRAF2、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK显著增加(P<0.05);TG逆转了LT对高糖诱导的VSMCs增殖、凋亡和迁移的作用(P<0.05)。结论 LT可以抑制高糖诱导的VSMCs增殖和迁移,促进其凋亡,可能与抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路有关。

TRAF6/Runx2信号轴对牙龈卟啉单胞菌诱导血管平滑肌细胞钙化调控作用的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)/Runt-相关转录因子-2(Runt-related-transcription factor-2,Runx2)信号轴对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)诱导小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)钙化的调控作用。方法:用热灭活的P.gingivalis和VSMC共培养,在21 d时检测VSMC的钙化沉积和钙含量;并检测VSMC收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α),以及成骨标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OC)和Ⅰ型胶原A1(type I collagen A1,ColⅠA1)的基因和蛋白表达。此外,检测P.gingivalis诱导VSMC后TRAF6和Runx2的表达,进一步通过抑制TRAF6,检测其对Runx2表达以及VSMC和主动脉的钙化情况的作用。结果:P.gingivalis可促进VSMC发生钙化沉积以及钙含量增加(P<0.05);并且P.gingivalis能显著促进成骨标志物的表达,抑制VSMC收缩标志物表达(P<0.05);当抑制TRAF6表达时,能降低P.gingivalis诱导VMSC中Runx2的表达,并抑制VSMC和主动脉壁的钙化沉积,显著降低VSMC中钙含量(P<0.05)。结论:P.gingivalis促进VSMC成骨标志物表达,抑制收缩标志物表达,最终诱导VSMC发生钙化;并进一步证实P.gingivalis可通过TRAF6/Runx2信号轴调控VSMC和主动脉钙化。

LncRNA NORAD通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用机制

目的:探讨长链非编码RNA DNA损伤诱导的非编码RNA(LncRNA NORAD)通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测人颅内动脉瘤组织和正常组织中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表达。体外分离培养人VSMC,随机分为对照组、LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组、共转染(LncRNA NORAD siRNA+miR-513b-5p inhibitor)组、共转染阴性对照(LncRNA NORAD siRNA阴性对照+miR-513b-5p inhibitor阴性对照)组,分组转染后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况;采用Hoechst 33342染色和免疫荧光染色检测各组细胞凋亡情况;采用细胞划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭情况;采用免疫印记实验检测各组细胞上皮间充质转化(EMT)标志蛋白神经钙黏素(N-cadherin)、E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达;采用双荧光素酶报告实验分析VSMC中LncRNA NORAD对miR-513b-5p、miR-513b-5p对GREM1的靶向调控。结果:与正常组织比较,颅内动脉瘤组织LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表达明显升高(P<0.05),miR-513b-5p表达明显降低(P<0.05)。与对照组比较,LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);共转染阴性对照组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。与LncRNA NORAD siRNA组比较,共转染组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。结论:敲低LncRNA NORAD可通过上调miR-513b-5p表达而降低GREM1表达,从而抑制VSMC增殖与侵袭迁移,并促使其凋亡。

别嘌醇下调尿酸介导的大鼠血管平滑肌细胞赖安酰氧化酶的表达

目的研究别嘌醇对尿酸介导的大鼠血管平滑肌细胞赖安酰氧化酶(LOX)和磷酸化p-38(P-p38)表达的影响。方法大鼠血管平滑肌细胞分为三组:空白对照组;尿酸组(尿酸40 mg/L干预48 h);别嘌醇组(尿酸40 mg/L及别嘌醇0.3 mmol/L干预48 h)。共聚焦显微镜观察细胞内活性氧情况。提取大鼠血管平滑肌细胞RNA和蛋白,实时荧光定量PCR和Western Blot测定LOX、p-38及P-p38mRNA和蛋白表达。结果尿酸组血管平滑肌细胞增殖量、细胞内活性氧、LOX及P-p38的mRNA和蛋白水平明显高于对照组;别嘌醇组血管平滑肌细胞增殖量、细胞内活性氧、LOX及P-p38的mRNA和蛋白表达水平明显下调(P<0.01)。结论别嘌醇可抑制尿酸介导的大鼠血管平滑肌细胞LOX和P-p38表达。

冠心宁通过TNFAIP3-ASK1/JNK通路对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转换的调控作用

目的探讨冠心宁(GXN)调控动脉粥样硬化(AS)斑块稳定性的分子机制。方法制备含有GXN药物的血清,利用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)构建AS体外模型,Western blot和qPCR检测VSMC表型转换情况。通过沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3),检测GXN对VSMC表型转换的影响。构建凋亡信号调节激酶1(ASK1)过表达载体,并利用Lip3000转染进细胞,检测GXN是否通过凋亡信号调节激酶1/c-Jun氨基末端激酶(ASK1/JNK)通路发挥作用。结果与对照组比较,ox-LDL组的细胞表型转换,表现为I型胶原蛋白(COLIA1和COLIA2)、TNFAIP3和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平降低(均P<0.01),基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13、骨桥蛋白(OPN)、ASK1磷酸化与ASK1比值(p-ASK1/ASK1)、JNK磷酸化与JNK比值(p-JNK/JNK)升高(均P<0.01);GXN处理后VSMC表型转换为收缩型,表现为与ox-LDL组相比COLIA1、COLIA2和α-SMA水平增高(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、TNFAIP3的表达水平、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都降低(均P<0.01)。沉默TNFAIP3后,与ox-LDL+10%GXN+sh-NC组相比,COLIA1、COLIA2、TNFAIP3和α-SMA水平降低(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都升高(均P<0.01)。过表达ASK1后,与ox-LDL+10%GXN+oe-NC组相比,COLIA1、COLIA2和α-SMA的表达水平降低(均P<0.01),MMP2、MMP9、MMP13、OPN、p-ASK1/ASK1以及p-JNK/JNK都升高(均P<0.01)。结论GXN可能通过TNFAIP3调控ASK1/JNK通路介导VSMC表型转换,从而起到稳定动脉硬化斑块的作用。

红景天苷通过抑制TLR 4/NF-κB通路抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化

【目的】本文旨在探讨红景天苷对血管平滑肌细胞钙化的作用及机制。【方法】本研究采用人血管平滑肌细胞钙化模型,用不同浓度的红景天苷处理细胞,茜素红染色及钙离子浓度定量检测细胞钙化,Western blot检测红景天苷对成骨样分化蛋白Runt相关转录因子2(RUNX2)和骨形态发生蛋白2(BMP2)的影响;检测红景天苷对Toll样受体4(TLR4)、核因子κB p65(NF-κB p65)和磷酸化的核因子κB p65(p-NF-κB p65)的影响;检测红景天苷对白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)的影响。采用TLR4小干扰RNA(si-TLR4)处理血管平滑肌细胞,研究TLR4介导红景天苷对平滑肌细胞钙化的抑制作用。【结果】茜素红染色及钙离子浓度定量结果提示不同浓度的红景天苷改善高磷诱导的人血管平滑肌细胞的钙化(P<0.05)。与高磷模型组相比,红景天苷(250μmol/L、500μmol/L)下调成骨样分化蛋白RUNX2(P<0.05)和BMP2(P<0.05);250μmol/L、500μmol/L浓度的红景天苷还下调高磷诱导的TLR4(P<0.05)和p-NF-κB p65(P<0.05)的表达,而对NF-κB p65影响无显著差异(P>0.05);红景天苷(250μmol/L、500μmol/L)抑制炎症因子IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.05)的蛋白水平。此外,茜素红染色及钙定量提示,红景天苷可增强敲低TLR4对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的抑制作用(P<0.05)。【结论】红景天苷可通过抑制TLR4/NF-κB通路抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化。

miR-29b通过KLF4调控血管平滑肌细胞增殖及表型蛋白表达

目的探讨微小RNA-29b(microRNA-29b,miR-29b)通过靶向作用于Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)信号通路对血管平滑肌细胞增殖及表型蛋白表达的影响。方法将血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分为4组:无义序列对照组(control+NC)、miR-29b过表达对照组(control+miR-29b)、无义序列模型组(ox-LDL+NC)、miR-29b过表达模型组(ox-LDL+miR-29b)。对照组细胞正常培养;模型组细胞采用80 mg/L氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导24 h建立模型。细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测VSMCs的增殖情况;实时荧光定量PCR检测miR-29b、单核细胞化学趋化因子1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、MCP-3、α平滑肌肌动蛋白(smooth muscleα-actin,SMα-actin)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM MHC)及KLF4的mRNA表达水平;酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测培养上清中MCP-1、MCP-3水平;Western blot检测蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验检测miR-29b对KLF4的靶向作用。结果ox-LDL刺激VSMCs后,细胞中miR-29b表达量显著下降。与ox-LDL+NC组相比,ox-LDL+miR-29b组细胞增殖减少,炎症因子MCP-1和MCP-3的表达降低,收缩表型蛋白SMα-actin、SM MHC的表达显著升高,KLF4表达下降。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-29b能与KLF4 mRNA的3′端非翻译区(3′UTR)结合。过表达KLF4可抑制miR-29b的作用。结论miR-29b可靶向作用于KLF4,调控ox-LDL诱导的VSMCs增殖、炎症因子的表达及表型蛋白表达的变化。

miRNA-195在腹主动脉瘤血管平滑肌细胞中作用机制探讨

目的探讨miRNA-195在大鼠腹主动脉瘤中表达及对血管平滑肌细胞的作用。方法建立大鼠腹主动脉瘤模型,实时荧光定量PCR检测miRNA-195在腹主动脉瘤组织中的表达量;血管平滑肌细胞中转染miRNA抑制物,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测MMP-2、MMP-9和OPN蛋白表达。结果miRNA-195在大鼠腹主动脉瘤组织中呈高表达;血管平滑肌细胞中转染miRNA-195抑制物后,转染组细胞的增殖能力在48 h、72 h和96 h比对照组提高40.5%(P<0.05)、39.7%(P<0.01)、36.1%(P<0.001),且转染组细胞凋亡率比对照组降低35.6%(P<0.001),MMP-2蛋白、MMP-9蛋白和OPN蛋白在转染组中表达量分别比对照组降低45.4%、36.8%和48.8%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-195表达升高导致血管平滑肌细胞数量减少,并可能通过上调MMP-2和MMP-9蛋白表达致细胞外基质发生降解,从而促进腹主动脉瘤的形成和发展。

基于平滑肌细胞表型转化角度探讨中医药治疗动脉粥样硬化进展

动脉粥样硬化是一种以纤维斑块和粥样斑块为主要病理特征的血管系统疾病。当纤维斑块或粥样斑块形成后,使动脉壁增厚、变硬,导致动脉管腔狭窄、弹性下降,甚至可导致急性冠状动脉综合征、缺血性脑卒中等并发症的发生,是多种心脑血管疾病的病理基础。血管平滑肌细胞主要环形分布于血管壁的中膜内,与血管的顺应性及弹性回缩密切相关,在生理情况下,血管平滑肌细胞具有收缩力强的特性,保持着低增殖、低迁移功能,在不同的环境条件影响下,血管平滑肌细胞会发生表型转化,从收缩表型向合成表型转化,促使平滑肌细胞由中膜迁移至内膜,随后在内膜中大量积聚并刺激结缔组织的形成,进而导致斑块失稳、管腔狭窄甚至斑块破裂等病理过程的发生。该文阐述了血管平滑肌与动脉粥样硬化发生发展的关系,并总结近十年中医药通过调控血管平滑肌细胞防治动脉粥样硬化的进展,旨在为中医药防治动脉粥样硬化提供更为可靠的理论依据。