小檗碱通过PERK-ATF4通路对高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的改善作用

目的 基于内质网应激(ERS)蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-激活转录因子4(ATF4)通路探讨小檗碱减轻高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)钙化的相关机制。方法 体外培养大鼠VSMC细胞,分为对照组,高糖组(35 mmol/L葡萄糖),小檗碱低、中、高剂量组(35 mmol/L葡萄糖+50、100、200μmol/L小檗碱),小檗碱+pcDNA组(35 mmol/L葡萄糖+200μmol/L小檗碱+转染pcDNA),小檗碱+pcDNA-ATF4组(35 mmol/L葡萄糖+200μmol/L小檗碱+转染pcDNA-ATF4)。RT-qPCR法检测ATF4 mRNA表达,甲基百里香酚蓝比色法检测钙水平,磷酸苯二钠法检测ALP活性,Western blot法检测p-PERK、PERK、ATF4、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix蛋白表达。结果 与对照组比较,高糖组VSMC细胞钙水平、ALP活性及细胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达升高(P<0.05);与高糖组比较,小檗碱各剂量组以上指标均降低(P<0.05),并呈剂量依赖性;与小檗碱+pcDNA组比较,小檗碱+pcDNA-ATF4组钙水平、ALP活性及细胞中ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达及ATF4 mRNA表达均升高(P<0.05)。结论 小檗碱能减轻高糖诱导的VSMC细胞钙化,其机制可能与抑制PERK-ATF4通路的激活有关。

钙磷诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化的机制研究

目的:探讨氧化应激损伤在钙磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化过程中的作用机制。方法:采用氯化钙(Ca Cl2)联合β-甘油磷酸钠(β-GP)建立大鼠VSMCs钙化模型。实验分为4组,对照组、钙化组、钙化+过氧化氢(H2O2)组和钙化+过氧化氢酶组。8天后分别通过茜素红S染色法和邻甲酚肽络合酮比色法检测各组细胞钙结节形成及钙含量;活性氧检测试剂盒(DCFH-DA探针)检测各组细胞活性氧阳性细胞数;蛋白免疫印迹法检测各组细胞中成骨转录因子Runx2的蛋白表达量。结果:钙化组活性氧的产生、钙结节、钙含量及Runx2蛋白表达量均显著高于对照组,钙化+过氧化氢组与钙化组相比,各项指标进一步升高,差异有统计学意义(P<0.05)。钙化+过氧化氢酶组活性氧产生量、钙结节、钙含量及Runx2蛋白表达量均低于钙化组和钙化+过氧化氢组,仍高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但其中Runx2蛋白表达量与对照组相比则差异无统计学意义(P>0.05)。结论:氯化钙联合β-GP通过激活ROS-Runx2信号通路诱导大鼠VSMCs钙化形成。

枸橼酸镁激活钙敏感受体抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化

目的探讨枸橼酸镁(magnesium citrate,MgCit)抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化的作用及其机制。方法VSMCs分为正常对照组、高磷组、低剂量MgCit组、高剂量MgCit组和高剂量MgCit+NPS2143(钙敏感受体抑制剂)组;茜素红染色半定量分析VSMCs钙化情况并利用试剂盒检测VSMCs内的钙含量;检测各组细胞成骨样转分化指标,包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,以及平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)、核心转录因子(runt-related transcription factor 2,RUNX2)和骨形态蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组相比,高磷组VSMCs的钙含量增加,ALP活性、RUNX2和BMP2的mRNA和蛋白表达增加,SM22α的mRNA表达降低(P<0.05);MgCit能降低高磷诱导的VSMCs的钙化,同时降低ALP活性,降低RUNX2和BMP2的mRNA和蛋白表达,增加SM22α的mRNA表达(P<0.05);当同时给予NPS2143时,MgCit的以上作用被削弱(P<0.05)。结论MgCit能降低高磷诱导的VSMCs的钙化和成骨样转分化程度,该作用与MgCit激活钙敏感受体(CaSR)有关。

泛素特异性蛋白酶22通过调控雌激素受体α的转录活性抑制磷诱导的人动脉平滑肌细胞钙化

目的探讨泛素特异性蛋白酶22(USP22)与雌激素/雌激素受体(ER)之间的关系,并明确USP22在血管钙化过程中的作用及机制。方法用高磷培养基处理人动脉平滑肌细胞(HASMCs),建立血管钙化的细胞模型,并通过钙含量比色检测试剂盒及茜素红染色对该模型进行评价;Western blotting观察钙化过程中USP22蛋白水平的变化情况;双荧光素酶报告试验检测USP22对于ERα的转录调控作用;免疫共沉淀试验(co-IP)检测USP22与ERα之间的相互作用;对HASMCs进行过表达/沉默USP22之后再通过钙含量比色检测试剂盒检测钙化的改变。结果成功建立HASMCs钙化模型,钙含量比色检测试剂盒测定结果显示,细胞钙含量明显升高(P<0.05),茜素红染色也提示平滑肌细胞钙化阳性。随着钙化培养基处理时间的延长,Western blotting检测发现HASMCs的Runt相关转录因子(Runx2)与USP22蛋白表达量均有所升高。双荧光素酶报告试验结果显示,USP22可以抑制ERα的转录活性(P<0.05)。co-IP证实USP22与ERα之间可以结合。过表达USP22时,细胞钙化加重,Runx2表达也升高;沉默USP22时,细胞钙化减轻,Runx2表达也下降(P<0.05)。结论高磷条件可以诱导HASMCs钙化,HASMCs钙化时USP22表达水平升高,USP22可以通过与ERα直接结合的方式抑制其转录活性,USP22通过ERα促进钙化。

MiR-133a调控BMP-2诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的机制

目的研究MiR-133a调控BMP-2诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的机制。方法采用BMP-2处理大鼠血管平滑肌细胞72h建立成骨样细胞分化模型。实验分组与细胞处理方法:1)空白对照组:采用溶媒处理血管平滑肌细胞72h;2)模型对照组:采用BMP-2处理血管平滑肌细胞72h;3)MiR-133a组:采用BMP-2处理MiR-133a转染的血管平滑肌细胞72h;4)MiR-NC组:采用BMP-2处理MiR-NC转染的血管平滑肌细胞72h。通过免疫荧光染色和细胞形态鉴定原代大鼠血管平滑肌细胞表型。检测大鼠血管平滑肌细胞内钙离子浓度、碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)水平、骨相关蛋白(Runx2、Osterix)表达及细胞凋亡情况。结果过表达MiR-133a能显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞钙离子浓度、ALP活性及OC水平的增加(P<0.05),能显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞Runx2、Osterix蛋白表达(P<0.05),同时能显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞的凋亡(P<0.05)。结论 MiR-133a可以显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化,其机制可能是抑制BMP-2引起的骨相关蛋白的增加和阻碍BMP-2诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。