血管平滑肌细胞调节性死亡参与主动脉瘤发生发展的作用研究

主动脉瘤是一种以主动脉局部或弥漫病理性扩张达到正常血管直径1.5倍及以上为主要病理特征,在65岁以上老年人中患病率超过10%的临床常见大血管疾病^([1])。主动脉瘤一旦发生瘤体破裂,引发的失血性休克和血流动力学紊乱极其凶险,对人类生命健康构成重大威胁。然而,主动脉瘤通常发病隐匿,大多数患者在瘤体破裂时缺乏明显的临床症状。目前,尚无有效治疗的药物,外科手术是预防和应对瘤体急性破裂的主要手段。

1,25(OH)_(2)D_(3)通过Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3凋亡机制抑制小鼠气道平滑肌细胞的增殖

目的探讨1,25(OH)_(2)D_(3)对过氧化氢(H_(2)O_(2))刺激的小鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)的抗增殖及促凋亡作用,并分析其在Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3凋亡机制发挥的调控作用。方法体外培养小鼠气道平滑肌细胞,再用不同浓度(0、25、50、100μmol/L)的H_(2)O_(2)刺激细胞增殖,作用不同时间(12、24、48、72 h),探索H_(2)O_(2)最佳作用浓度和时间。接着将ASMCs分为对照组、H_(2)O_(2)组、1,25(OH)_(2)D_(3)、H_(2)O_(2)+1,25(OH)_(2)D_(3)4组进行培养,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组ASMCs增殖活性的变化,并用流式细胞仪检测其凋亡情况。并用蛋白印迹法检测各组Bax、Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白的表达情况。结果H_(2)O_(2)刺激小鼠气道平滑肌细胞增殖的最佳作用浓度和时间分别为25μmol/L和24 h。1,25(OH)_(2)D_(3)干预能明显降低ASMCs增殖能力,并增加其凋亡率。H_(2)O_(2)+1,25(OH)_(2)D_(3)组细胞凋亡率为21.9%(对照组细胞凋亡率为7.1%,H_(2)O_(2)组细胞凋亡率为4.8%),差异具有统计学意义(P<0.01)。1,25(OH)_(2)D_(3)干预后,蛋白印迹法结果显示ASMCs的Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2表达水平下降。结论1,25(OH)_(2)D_(3)能抑制H_(2)O_(2)刺激ASMCs的增殖,并促进其凋亡,其机制与Bax/Bcl-2/ccleaved caspase-3凋亡通路有关。

ET-1对血管平滑肌细胞ANO1表达的影响及机制

目的探讨内皮素-1(ET-1)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)钙激活氯通道anoctamin 1(ANO1)表达的影响及机制。方法以不同浓度(0.1、1.0、10.0、100.0、1000.0 nmol/L)ET-1处理VSMCs 24 h或用1.0 nmol/L ET-1处理不同时间(1、6、12、24、48 h),观察ET-1对ANO1蛋白表达的影响。用磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路,检测磷酸化AKT(p-AKT)和ANO1蛋白表达的变化。采用组织贴块法进行大鼠胸主动脉VSMCs的原代培养,采用Western blot法检测ANO1蛋白水平。结果0.1~1000.0 nmol/L ET-1处理明显促进ANO1蛋白表达(F=4.302,P<0.05),以1.0 nmol/L ET-1作用最为显著(q=8.707,P<0.05)。用1.0 nmol/L ET-1处理细胞不同时间后,ANO1蛋白表达水平增加(F=4.856,P<0.05),其中ET-1作用12~48 h ANO1表达差异具有统计学意义(q=2.903~5.673,P<0.05)。采用LY294002(10μmol/L)预处理后,与ET-1组相比较,LY294002+ET-1组p-AKT和ANO1蛋白的表达水平均显著降低(F=26.340、12.460,q=11.220、8.512,P<0.05)。结论ET-1对VSMCs的ANO1表达具有明显的上调作用,该作用可能和激活PI3K/AKT信号通路有关。

沙库巴曲缬沙坦对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨沙库巴曲缬沙坦(Entresto)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激下血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响。方法体外培养人主动脉VSMCs,随机分为AngⅡ组(用AngⅡ处理)、AngⅡ+Entresto组(Entresto处理细胞1 h,换液后再加入AngⅡ处理细胞)、对照组(不加药物处理),各组均培养24 h。应用CCK8方法检测细胞增殖,划痕实验方法检测细胞迁移活性,实时荧光定量PCR及Western blot方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平。结果与对照组比较,AngⅡ组VSMCs细胞增殖率、迁移活性、PCNA及MMP-9表达增高(F=16.54~177.20,P<0.05);与AngⅡ组相比较,AngⅡ+Entresto组VSMCs细胞增殖率、迁移活性、PCNA及MMP-9表达降低(P<0.05)。结论Entresto能抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖及迁移。

镁离子对大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响

目的：探讨不同浓度镁离子对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响。方法原代培养获取VSMCs，进行形态学及免疫细胞鉴定，后将VSMCs随机分为阴性对照组、高磷组、镁干预组。阴性对照组采用含10%胎牛血清培养，高磷组采用高磷培养基培养，镁干预组在高磷培养基的基础上分别加入不同浓度氯化镁，使镁离子终浓度分别为1、2、3 mmol/L（镁干预组1~3），刺激7 d后行钙化检测，测定钙含量及碱性磷酸酶（ALP）活性，并行反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞内核心结合因子α1（Cbfα1）mRNA的表达。结果高磷组和镁干预组VSMCs均有钙盐沉积，其钙含量均高于阴性对照组；镁干预组随镁离子浓度增大钙化结节逐渐缩小，除镁干预组1钙含量与高磷组差异无统计学意义外，镁干预组2和镁干预组3均低于高磷组（均P＜0.05）。VSMCs ALP活性和Cbfα1 mRNA的表达除镁干预组3与阴性对照组差异无统计学意义外，其余组均高于阴性对照组（P＜0.05）。镁干预组随镁离子浓度增大，ALP活性和Cbfα1 mRNA的表达水平均逐渐降低，且均低于高磷组（P＜0.05）。结论镁离子可在一定程度上抑制高磷诱导的VSMCs钙化和成骨样转分化，其可能是通过降低VSMCs中Cbfα1的表达来实现的。

BMP信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化中的作用。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMC,将其随机分为正常对照组、高磷组、华法林(10μmol/L)干预组及华法林(10μmol/L)+维生素K(10μmol/L)干预组。对细胞进行钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,茜素红染色检测钙结节,Western blot检测细胞中Runx2蛋白的表达变化,RT-PCR检测细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Smad1及Runx2的表达变化。结果茜素红染色结果显示,与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组钙化结节明显增多;钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致。与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组ALP活性明显增加(P<0.05),Runx2 mRNA和蛋白表达水平及BMP-2、Smad1 mRNA表达明显增高(P<0.05);与华法林干预组相比,华法林+维生素K干预组细胞钙含量、ALP活性及BMP-2、Smad1、Runx2的表达均明显降低(P<0.05)。结论BMP信号通路参与了华法林促进的大鼠VSMC钙化,其可能的作用机制是介导了VSMC的表型转化。

主动脉疾病中血管平滑肌细胞表型转化调控机制研究进展

主动脉疾病(aortic disease,AD)指由于主动脉壁病变所致的一类疾病,往往高度致命。目前非遗传性AD的发病机制尚未完全阐明。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是主动脉壁中层的主要细胞成分,通常认为其存在收缩型与合成型两种表型,且可相互转化。VSMC由收缩型向合成型的过度转化在AD的发生发展过程起重要作用。尽管关于VSMC表型转化研究较多,但众多调控机制如何协调运作以及相互之间的关系仍然有待阐明。本文就目前已知的VSMC表型转化调控机制作一综述。

雌二醇诱导的慢性非细菌性前列腺炎大鼠前列腺平滑肌细胞电压依赖钙离子通道的定量表达

目的:建立慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型,探讨炎症组与正常对照组大鼠前列腺平滑肌细胞电压依赖钙离子通道定量表达的差异性。方法:采用雌二醇诱导大鼠前列腺炎,体外培养纯化前列腺平滑肌细胞(PSMCs),用Trizol提取总RNA,经逆转录,SYBR Green I实时定量PCR测定各亚型钙离子通道α1亚基的mRNA相对表达水平,比较两组间的差异。结果:炎症组和对照组均见L、T、P/Q型钙通道表达,炎症组L型钙通道CaV1.2相对对照组表达量增多,分别为0.048±0.024和0.031±0.015,差异具有显著性(t=2.846,P=0.007),T、P/Q型两组间无统计学差异。结论:慢性前列腺炎PSMCs细胞膜L型钙通道CaV1.2数目上调,钙内流增多,在发病机制中可能具有一定作用。

维拉帕米通过阻断钙离子内流抑制血管平滑肌细胞钙化研究

目的探讨维拉帕米抑制高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的作用及可能机制。方法2014年12月—2015年6月选取5~8周龄清洁级健康雄性SD大鼠6只,体外分离培养大鼠VSMCs,采用免疫组化法鉴定。将对数期VSMCs随机分为正常对照组〔含10%胎牛血清（FBS）培养基〕、高磷组（高磷培养基,含10 mml/Lβ-甘油磷酸）、维拉帕米干预组（在高磷培养基的基础上加入维拉帕米至浓度为20 mmol/L）。细胞接受2、4、6 d干预后,检测VSMCs内钙离子水平,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测VSMCs内目的基因（smad1、runx2mRNA）表达水平。细胞接受14 d干预后进行钙化检测,包括钙水平测定和茜素红染色情况。结果高磷组、维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内钙离子水平均高于正常对照组（P〈0.05）;维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内钙离子水平均低于高磷组（P〈0.05）。高磷组、维拉帕米干预组4、6 d后VSMCs内钙离子水平分别高于2 d后（P〈0.05）;高磷组6 d后VSMCs内钙离子水平高于4 d后（P〈0.05）;维拉帕米干预组6 d后VSMCs内钙离子水平低于4 d后（P〈0.05）。高磷组、维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平均高于正常对照组（P〈0.05）;维拉帕米干预组2、4、6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平均低于高磷组（P〈0.05）。高磷组4、6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平分别高于2 d后,6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平分别高于4 d后（P〈0.05）;维拉帕米干预组4 d后VSMCs内smad1 mRNA表达水平高于2 d后,runx2 mRNA表达水平低于2 d后,6 d后VSMCs内smad1、runx2 mRNA表达水平均高于2、4 d后（P〈0.05）。高磷组、维拉帕米干预组VSMCs钙水平均高于正常对照组（P〈0.05）;维拉帕米干预组VSMCs钙水平低于高磷组（P〈0.05）。高磷组、维拉帕米干预组橘红色钙化结节较正常对照组多,维拉帕米干预组橘红色钙化结节较高磷组少。结论维拉帕米在高磷诱导的VSMCs钙化中起抑制作用,其可能是通过抑制钙离子内流进而抑制smad1表达,进一步抑制runx2表达,进而抑制VSMCs发生表型转化来实现的。

瞬时受体电位香草酸亚型1通道影响支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖和炎症的研究

目的探讨瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）通道对支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖和炎症的影响。方法 2013年6月—2014年6月,选取5～6周龄清洁级健康雄性SD大鼠60只,采用随机数字表法分为：正常对照组、支气管哮喘组、支气管哮喘＋辣椒素（CAP）组、支气管哮喘＋辣椒卓平（CPZ）组,每组15只。支气管哮喘组、支气管哮喘＋CAP组、支气管哮喘＋CPZ组大鼠制作支气管哮喘模型,支气管哮喘＋CAP组大鼠给予含有0.01%CAP的饲料喂养,支气管哮喘＋CPZ组大鼠给予含有0.01%CPZ的饲料喂养。病理学检查显微镜下找到完整肺内支气管横断面,计算管壁面积（WA）/管腔内周长（Pi）、支气管平滑肌面积（S）/Pi、支气管平滑肌细胞核数（N）/Pi,采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RT-q PCR）和Western blotting法检测气管平滑肌组织TRPV1、增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA及其蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测大鼠气管平滑肌组织白介素（IL）-4、IL-5、IL-13表达水平。结果支气管哮喘组和支气管哮喘＋CAP组大鼠气管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于对照组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CAP组大鼠气管WA/Pi、S/Pi、N/Pi高于支气管哮喘组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CPZ组大鼠气管WA/Pi、S/Pi、N/Pi低于支气管哮喘＋CAP组（P〈0.05）。支气管哮喘组和支气管哮喘＋CAP组大鼠气管平滑肌组织TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表达水平高于对照组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CAP组大鼠气管平滑肌组织TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表达水平高于支气管哮喘组（P〈0.05）;支气管哮喘＋CPZ组大鼠气管平滑肌组织TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13表达水平低于支气管哮喘和支气管哮喘＋CAP组（P〈0.05）。结论 TRPV1、PCNA mRNA及其蛋白、IL-4、IL-5、IL-13在支气管哮喘大鼠气管平滑肌组织中高表达,阻断TRPV1通道后,气管平滑肌组织增生和炎症均明显减轻,提示TRPV1通道可能在支气管哮喘大鼠气管平滑肌细胞增殖和炎症形成中发挥重要作用。

细胞凋亡在维生素K_2抑制高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的：探讨维生素 K2对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响及细胞凋亡在其中所起的作用。方法选取8~10周龄健康雄性 SD 大鼠6只，分别体外分离培养大鼠胸主动脉 VSMCs，采用免疫细胞化学方法鉴定。将 VSMCs 采用随机数字表法分为正常对照组、高磷组、维生素 K2组1（10μmol/ L）、维生素 K2组2（25μmol/ L）及维生素 K2组3（50μmol/ L）。检测 VSMCs 钙含量、Axl mRNA 和 Bcl -2 mRNA 表达、细胞凋亡率。结果5组大鼠 VSMCs 钙含量比较，差异有统计学意义（P ﹤0.05）。高磷组、维生素 K2组1、维生素 K2组2、维生素 K2组3均高于正常对照组（P ﹤0.05）；维生素 K2组1、维生素 K2组2、维生素 K2组3均低于高磷组（P ﹤0.05）；维生素K2组2、维生素 K2组3均低于维生素 K2组1（P ﹤0.05）；维生素 K2组3低于维生素 K2组2（P ﹤0.05）。5组大鼠VSMCs 中 Axl mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P ﹤0.05）。高磷组、维生素 K2组1 Axl mRNA 表达水平低于正常对照组，维生素 K2组3 Axl mRNA 表达水平高于正常对照组，维生素 K2组2、维生素 K2组3 Axl mRNA 表达水平高于高磷组（P ﹤0.05）。5组大鼠 VSMCs 中 Bcl -2 mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P ﹥0.05）。5组大鼠细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P ﹤0.05）。高磷组、维生素 K2组1细胞凋亡率高于正常对照组，维生素 K2组1、维生素 K2组2、维生素 K2组3细胞凋亡率低于高磷组（P ﹤0.05）。结论维生素 K2能够抑制高磷诱导的大鼠 VSMCs钙化，其机制可能是通过上调生长停滞特异基因6（Gas6）/ Axl 的表达而抑制了 VSMCs 的凋亡。

慢性非细菌性前列腺炎SD大鼠前列腺平滑肌细胞内钙离子浓度的变化

目的:探讨SD大鼠慢性非细菌性前列腺炎(CAP)炎症组与正常对照组前列腺平滑肌细胞(PSMCs)内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的差异及其在CAP中的意义。方法:利用SD大鼠前列腺蛋白提取液与弗氏完全佐剂(FCA)诱导出CAP模型,体外贴壁培养并纯化炎症组与正常对照组PSMCs,细胞经钙离子荧光探针FLUO-3AM孵育后在激光共聚焦显微镜(LSCM)下连续动态扫描。结果:CAP组与对照组的PSMCs钙离子荧光强度分别为80.39±9.00和27.95±10.04,差异具有显著性(P<0.01)。结论:CAP SD大鼠PSMCs[Ca2+]i明显升高,其升高可能增强了PSMCs的收缩作用,从而引起CAP的一系列如对疼痛敏感性增强、下腹部疼痛不适的症状。

钾通道与肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡关系中钙通道所起作用的研究

目的:观察钾通道与肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡关系中钙通道所起的作用。方法:将PASMC分为对照、钾通道阻断剂四乙胺TEA(开放剂比那地尔Pin)、钾通道阻断剂(开放剂)+钙通道阻断剂硝苯地平Nif(开放剂BayK8644)组,采用非核素增殖试剂盒、3HTdR掺入测定细胞增殖。将PASMC分为对照、钾通道开放剂、钾通道开放剂+钙通道开放剂组,采用细胞凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡。结果:与对照组相比,10～20mmol/L的钾通道阻断剂TEA显著增加PASMC细胞数(P<0.01),15～30mmol/LTEA显著增加DNA合成(P<0.05,P<0.01)。TEA+5μmol/LNif组中只有20mmol/LTEA使DNA合成增加(P<0.05),其余浓度组与对照组均无统计学差异。TEA+Nif组与TEA组相比,TEA浓度在10～25mmol/L时2组细胞数相差显著(P<0.01),15～30mmol/LTEA时2组DNA合成相差显著(P<0.05,P<0.01)。与对照组相比,25～500μmol/LPin显著减少PASMC细胞数和DNA合成(P<0.01)。Pin+1μmol/LBay组与Pin组相比,当Pin浓度为25～500μmol/L时2组PASMC细胞数相差显著(P<0.01),当Pin浓度在50～500μmol/L时DNA合成相差显著(P<0.01)。Pin+Bay组与对照组相比,50～500μmol/L的Pin仍能显著减少PASMC细胞数(P<0.01),25～500μmol/L的Pin显著减少DNA合成(P<0.01)。与对照组相比。

菟丝子黄酮对去势雌性大鼠血清雌激素水平和血管平滑肌细胞的影响

目的:观察补肾中药菟丝子的有效成分菟丝子黄酮对老年血管的保护作用,并探讨其作用机制。方法:菟丝子经溶剂提取、聚酰胺柱分离得黄酮提取物。SD雌性大鼠随机分成正常对照组,模型对照组,菟丝子黄酮高、低剂量组及阳性对照组。实验动物按分组造模、给药42d后,观察血清中的雌激素水平和主动脉平滑肌细胞凋亡率的变化。结果:菟丝子黄酮能上调去势雌性大鼠血清雌激素水平(P<0.01),提高其主动脉平滑肌细胞早期凋亡率(P<0.01)。结论:菟丝子黄酮通过升高雌激素水平和促进主动脉平滑肌细胞凋亡发挥其对老年血管的保护作用。

eNOS、CAV1、PI3K/Akt信号通路在同型半胱氨酸促进大鼠血管平滑肌细胞迁移、增殖中的作用研究

目的探讨内皮型一氧化氮合酶(e NOS)、小凹蛋白-1(CAV1)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在同型半胱氨酸(Hcy)促进大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移、增殖中的作用。方法 2016年1—6月采用组织贴块法分离SDF级SD大鼠胸主动脉中膜并传代培养VSMCs,取4~7代细胞用于实验。细胞分为4组,分别为空白对照组、100μmol/L Hcy组、200μmol/L Hcy组、500μmol/L Hcy组,使用相应浓度Hcy(0、100、200、500μmol/L)进行干预培养,采用Transwell法检测VSMCs迁移能力、MTT法检测VSMCs增殖情况[以光密度(OD)值表示],硝酸还原酶法测定VSMCs释放NO情况,Western blotting检测VSMCs e NOS、CAV1、PI3K、p-Akt蛋白表达情况。结果 VSMCs穿膜细胞数与Hcy浓度呈正相关(r=0.582,P=0.020)。OD值与Hcy浓度呈正相关(r=0.620,P=0.015)。100、200、500μmol/L Hcy组释放NO低于空白对照组(P<0.05)。NO(r=-0.479,P=0.028),e NOS蛋白表达水平(r=-0.544,P=0.033)与Hcy浓度呈负相关。NO与e NOS蛋白表达水平呈正相关(r=0.721,P=0.009)。100、200、500μmol/L Hcy组VSMCs CAV1、PI3K、p-Akt蛋白表达水平均高于空白对照组(P<0.05)。CAV1蛋白表达水平(r=0.505,P=0.042),PI3K蛋白表达水平(r=0.428,P=0.030)、p-Akt蛋白表达水平(r=0.389,P=0.047)与Hcy浓度均呈正相关。结论 Hcy可能通过促进CAV1蛋白表达,抑制e NOS活性和NO释放,活化PI3K/Akt信号通路,从而诱导VSMCs的迁移和增殖,导致动脉粥样硬化。

脂多糖诱导下慢性阻塞性肺疾病大鼠模型远端肺动脉平滑肌细胞中Toll样受体4表达情况研究

背景慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以不完全可逆的气流受限为特征的慢性支气管炎和肺气肿,也是导致肺动脉高压的主要原因之一,但其发生发展机制尚未完全清楚。目的探讨脂多糖(LPS)诱导下COPD大鼠模型远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中Toll样受体(TLR)4表达情况,以期为探讨TLR4信号通路在COPD炎性反应及免疫应答中的作用提供理论基础。方法 2015年12月—2016年3月,选取SPF级Wistar大鼠24只,雌雄对半,6~8周龄。适应性饲养大鼠1周后,将其随机分为模型组和正常组,各12只。模型组大鼠于实验第1、14天经气道注入1μg/ml的LPS 200μl,置于自制有机玻璃舱,烟熏1 h/d,共8周;正常组大鼠于实验第1、14天经气道注入等量0.9%氯化钠溶液,与模型组大鼠在同等条件下饲养8周。8周后,两组分别随机选取2只大鼠,开胸取肺组织,分别进行HE染色观察肺组织病理学改变和免疫组织化学染色观察肺动脉平滑肌层TLR4表达情况。从模型组剩余大鼠中随机选取6只,分离、培养远端PASMCs,选用第3~6代(对数生长期)细胞,光镜下(×100)观察PASMCs形态,采用免疫荧光法(荧光显微镜下,×200)观察其α-肌动蛋白表达情况,并随机分为对照组(不进行干预)、LPS 12 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用12 h)、LPS 24 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用24 h)、LPS 48 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用48 h)、LPS 72 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用72 h),采用Western blotting法检测各组PASMCs中TLR4表达水平。结果肺组织病理学改变:模型组肺泡壁断裂,肺泡融合,肺大泡形成,肺动脉平滑肌层明显增厚,大量炎性细胞浸润,病理表现符合典型的COPD病理改变。肺动脉平滑肌层TLR4表达情况:模型组倒置相差显微镜下可见TLR4表达阳性,且肺动脉平滑肌层染成黄色较正常组颜色明显加深。PASMCs形态及其α-肌动蛋白表达情况:光镜下PASMCs呈梭形、不规则生长,随着培养时间的延长,层数增多,堆积形成"峰-谷"状;荧光显微镜下可见PASMCs胞质α-肌动蛋白表达阳性,胞质中有向细胞两极呈放射状分布的条丝状物,与细胞长轴平行,形态清晰。LPS 12 h组、LPS 24 h组、LPS 48 h组、LPS 72 h组PASMCs中TLR4表达水平均高于对照组(P<0.05);LPS 24 h组、LPS 48 h组、LPS 72 h组PASMCs中TLR4表达水平均高于LPS 12 h组(P<0.05);LPS 48 h组、LPS 72 h组PASMCs中TLR4表达水平均高于LPS 24 h组(P<0.05)。结论 LPS诱导下COPD大鼠模型远端PASMCs中TLR4表达水平升高,猜测LPS可能通过TLR4信号通路诱导PASMCs的合成分泌功能,从而加重炎性反应及肺血管重塑。

紫杉醇水蛭素复合物对兔血管平滑肌细胞和内皮细胞增殖与迁移的影响

目的观察不同浓度紫杉醇水蛭素复合物对兔血管平滑肌细胞(smooth musele cell,SMC)和内皮细胞(endothelial cell,EC)增生、迁移的影响。方法培养兔血管SMC和EC,建立细胞共培养体系,模拟紫杉醇水蛭素复合物对血管SMC及EC的作用方式,观察不同浓度紫杉醇水蛭素复合物对兔血管SMC及EC的DNA合成、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达的影响,测定不同浓度紫杉醇水蛭素复合物对血管SMC及EC的迁移率。结果溶剂对照组SMC及EC的氚-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入、PCNA蛋白表达、迁移与空白对照组相比差异均无显著性。大、中、小剂量紫杉醇水蛭素复合物呈浓度依赖地抑制SMC的3H-TdR掺入、PCNA蛋白表达和迁移(n=6,p<0.05);在大、中剂量之间,紫杉醇水蛭素复合物呈浓度依赖地抑制EC的3H-TdR掺入、PCNA蛋白表达和迁移(n=6,p<0.05);但在小剂量组紫杉醇水蛭素复合物对EC的3H-TdR掺入、PCNA蛋白表达和迁移有抑制倾向,但与空白对照组相比差异均无显著性。结论小剂量的紫杉醇水蛭素复合物可显著抑制兔血管SMC的增生与迁移,但抑制EC的增生与迁移不明显。

体表海绵状静脉畸形中内皮细胞及平滑肌细胞分布与表型对血管塑形的影响

目的:研究内皮细胞、平滑肌细胞在体表海绵状静脉畸形中的分布与表型,并分析其发病机制和研究结果对疾病治疗和功能康复的意义。方法:实验于1996-06/2000-08在第二军医大学整形外科实验室完成。畸形组织25根,正常中小静脉各12根。苏木精-伊红染色观察比较畸形血窦壁和中小静脉壁中内皮细胞、平滑肌细胞的分布并计数分析。Envision法免疫组化染色,观察CD31,α平滑肌肌动蛋白在畸形和中小静脉中的分布。结果:畸形血窦壁中平滑肌细胞数量少,排列紊乱,平滑肌细胞与内皮细胞的比例显著低于微小静脉壁。畸形中CD31表达与中小静脉相似,但α平滑肌肌动蛋白的表达明显低于中小静脉,排列紊乱。结论:海绵状静脉畸形血窦壁中内皮细胞和平滑肌细胞发育不均衡,平滑肌细胞表型异常,导致血窦壁薄弱而在血窦内血液的压力下不断扩张,引起血管塑形障碍,这可能是病变发生和进展的原因。闭塞病理性血窦、阻断病变进展过程从而尽可能保留功能是临床治疗的重点。

蜂胶水提液影响血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖的作用

目的:观察蜂胶水提液对血管紧张素Ⅱ诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖作用的影响。方法:实验于2005-03/2006-04在泰山医学院基础医学研究所完成。组织块法培养人脐动脉平滑肌细胞,取3～5代细胞进行实验。将培养的人脐动脉平滑肌细胞随机分为4组:①对照组:不加任何药物。②模型组:加入100nmol/L的血管紧张素Ⅱ。③蜂胶组:分别加入50mg/L、100mg/L、200mg/L的蜂胶水提液预处理2h后,再加入终浓度为100nmol/L的血管紧张素Ⅱ。④氯沙坦组:加入1.5μmol/L的氯沙坦预处理2h后,再加入终浓度为100nmol/L的血管紧张素Ⅱ。同步化后,按分组分别加入处理药物孵育24h,倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化,同时计数细胞存活率,并用血细胞计数板计数各组细胞。采用流式细胞仪检测细胞周期,并分析细胞不同周期所占比例。采用免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原。计算增殖细胞核抗原阳性细胞百分率。增殖细胞核抗原阳性细胞百分率(%)=增殖细胞核抗原阳性细胞总数/血管平滑肌细胞总数×100%。结果:①相差倒置显微镜下观察各组细胞加药前后形态学无明显变化,细胞存活率均达95.0%以上。②模型组细胞计数高于对照组和氯沙坦组(P<0.01),100mg/L和200mg/L蜂胶组低于模型组(P<0.01);50mg/L和100mg/L蜂胶组高于氯沙坦组(P<0.01),200mg/L蜂胶组与氯沙坦组差异无显著性(P>0.05)。③模型组G0/Gl期细胞百分比低于对照组、氯沙坦组(P<0.01);100mg/L和200mg/L蜂胶组高于模型组(P<0.01);50mg/L蜂胶组低于氯沙坦组(P<0.05),100mg/L、200mg/L蜂胶组与氯沙坦组差异显著性(P>0.05)。④模型组增殖细胞核抗原阳性率高于对照组、氯沙坦组(P<0.01);100mg/L和200mg/L蜂胶组低于模型组(P<0.01),蜂胶各浓度组与氯沙坦组间差异无显著性意义。结论:血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞的增殖,氯沙坦能阻滞该作用;一定浓度的蜂胶水提液可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞的增殖,其机制可能与限制细胞由G1期向S期转变及增殖细胞核抗原的表达有关。

姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响及其机制.方法:采用组织块法体外培养大鼠VSMCs,MTT法测定姜黄素对VSMCs增殖的抑制作用,流式细胞术分析细胞凋亡,Western Blot印迹法检测VSMCsP21,P53,Bcl-2蛋白表达的变化.结果:MTT显示不同浓度姜黄素(7.5～120μmol/L)在24～72h范围内,浓度和时间依赖性抑制VSMCs增殖;流式细胞术显示30,60μmol/L姜黄素作用VSMCs24h后,凋亡率较对照组明显升高;30μmol/L姜黄素在不同时间点可上调VSMCsP21蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,对P53蛋白表达没有影响.结论:姜黄素具有明确的抑制VSMCs增殖,并能诱导血管平滑肌细胞凋亡,与上调VSMCsP21蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达有关.