平行等位基因特异序列检测技术对低比率乙型肝炎病毒耐药突变位点的检测

目的评价应用平行等位基因特异性序列检测技术(parallel allele-specific sequencing,PASS),对乙型肝炎病毒(HBV)进行耐药突变位点检测效果。方法应用PASS方法对17例未经抗病毒治疗和50例经抗病毒治疗失败的乙肝患者血浆进行耐药突变检测,其中50例乙肝抗病毒治疗失败的患者血浆同时采用测序法进行耐药分析。结果 17例未接受抗病毒治疗的患者样本中有8例检测到低比率的耐药突变位点(0.04%～16.89%),9例未发现有耐药突变。50例抗病毒治疗失败患者标本有7例PASS法和测序都未检测到耐药突变,16例PASS法检测到低比率耐药突变(0.03%～5.95%),测序法未检测到任何突变位点,27例PASS法和测序法都检测到了耐药突变(36%～100%)。应用PASS法进行连锁分析表明当多个耐药突变位点以高比率在同一患者体内检测到时,它们多以连锁的关系存在于同一病毒基因组。结论 PASS方法对检测HBV感染个体中耐药病毒群具有高度的灵敏性和特异性,并能对多个耐药突变位点进行连锁性分析。

基于序列特异扩增区域标记的栗疫菌巢式PCR检测技术

为建立栗疫菌(Cryphonectria parasitica)快速、准确的检测技术,利用随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)对不同来源地的栗疫菌和其他真菌分离物进行PCR扩增,筛选出栗疫菌的RAPD特异片段SCQ494。将特异RAPD片段SCQ494进行分离、回收,与载体pMD19-T载体连接,转化至大肠埃希菌进行培养,对目标片段克隆测序。根据测序结果,用Primer 5.0软件设计了序列特异扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)引物CQ1/CQ2和巢式PCR引物CR1/CR2。利用引物CQ1/CQ2通过常规PCR对不同来源地供试栗疫菌可扩增出1条约1 420bp的条带,对其他供试菌株DNA的PCR产物均无此条带,检测灵敏度为3pg/μL的基因组DNA;而以引物CQ1/CQ2为外圈引物和引物CR1/CR2为内圈引物进行的巢式PCR可从栗疫菌基因组DNA中扩增出1条大小约875bp的条带,灵敏度达到30fg/μL,是常规PCR的1000倍。验证实验表明巢式PCR可以从发病程度不同的栗树枝干和在自然感染的栗树枝条中检测出栗疫菌。

血小板特异抗原的基因定型:单核苷酸多态性的检测技术

在许多不同临床情况下,人们需要对病人的血小板特异性(人类血小板)抗原(HPA)进行准确定型,血液服务机构也需要备有已HPA定型的单采血小板供者和全血供者的名单,以帮助已被HPA同种免疫的病人。现报道有6种临床相关的HPA同种抗原系统,而且很多HPA同种抗原其等位基因频率的分布具高度不对称性或者有极低的免疫原性。某些已被很好鉴定的双等位基因系统如Gov还未被包括在HPA命名法内,但包含在本综述内。生物化学的研究使人们清楚认识了HPA抗原所在的血小板膜蛋白,在过去的十年里,人们对编码这些蛋白的基因进行了克隆,还发现新鲜血小板中含有多量的mRNA,这使人们得以揭示HPA的分子基础。所有的(除1个以外)双等位基因血小板特异性同种抗原均是基于DNA序列的单核苷酸多态性(SNP),它导致所编码的蛋白质的一级结构的单个氨基酸取代。同种抗原的遗传基础的揭示使得以聚合酶链式反应为基础、用基因组DNA进行HPA基因定型的技术得以充分发展。本综述讨论了HPA同种抗原的遗传基础、最常用的基因定型技术及其缺点和未来的发展。

中国人群HLA-B等位基因与HIV-1感染者疾病进程相关性研究

目的：通过对中国人群HIV-1感染典型进展者（Typical progressors，TP）和长期不进展者（Long-term nonpmgressors，LTNP）HLA-B等位基因的分布频率的研究，探讨中国人群HLA-B等位基因与HIV-1感染者疾病进程的关系。方法：采用整群随机抽样方法从河南、吉林、辽宁、新疆、云南五省收集356例未经抗病毒治疗的HIV-1感染者血样，其中289例典型进展者和67例长期不进展者。应用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）对其HLA-B等位基因特异性进行检测，并分析了他们的等位基因纯合子情况及Bw4／Bw6血清型，比较二组差异。结果：发现4个HLA-B等位基因位点在中国HIV-1感染人群中的表达频率较高，分别是HLA-B^＊13（TP：11．8％；LTNP：15．7％）、HLA-B^＊15（TP：17．3％；LTNP：8．2％）、HLA-B^＊40（TP：12．5％；LTNP：17．9％）、HIA-B^＊51（TP：9％；LTNP：10．4％）。其中长期不进展组HLA-B^＊67的等位基因频率为4．5％，典型进展组HLA-B^＊67的等位基因频率为1．2％，前者明显高于后者，具有显著性差异（P=0．022，OR=0．26，95％CI=0．08-0．89）。典型进展组的B^＊15的等位基因频率（17．3％）显著高于长期不进展组（8．2％）（P=0．009，OR=2．34，95％CI=1．18～4．76）。结论：HLA-B^＊67等位基因可能与延缓中国HIV-1感染者疾病进程相关，HLA-B^＊15等位基因可能与加速中国HIV-1感染者疾病进程相关。

平行等位基因特异性序列分析技术检测HIV-1感染者体内微量耐药病毒

高效抗病毒治疗（HAART）是目前治疗HIV感染者的首选方法，然而病毒准种中耐药突变的聚集最终会导致治疗的失败。在我国，由于大规模的抗病毒治疗也导致了耐药的发生，并存在较高的逆转录酶抑制剂交叉耐药现象，

应用RT-PCR技术检测葡萄扇叶病毒的研究

以扇叶病株为材料 ,根据病毒外壳蛋白核苷酸序列 ,设计特异引物P1(10 6 4 10 83) ,P2 (76 2 781) ,建立了以RNA为模板的GFLV的RT

山东地区AS患者HLA-B27基因多态性分析

目的凋查HLA-B27等位基因在山东地区的分布情况,研究亚犁水平的HLA-B27等位基因与AS的相关性.方法应用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术检测山东地区HLA-B27阳性AS患者中B2701～25的等位基因.结果在36例HLA-B27阳性的AS患者中,只检测到B*2704和B*2705两种业型等位基因,其中B*2704阳性13例,B*2705阳性23例,构成比分别是36.11%(13/36),63.89%(23/36).结论山东地区AS患者HLA-B27,等位基因以B*2704和B*2705为主,且B*2705最多见;不同地区、不同人群的AS患者,HLA-B27各亚型分布频率存在差异性.

新疆维吾尔族人自然长寿与HLADRB、ACE基因的关联分析

目的探讨人类白细胞抗原(HLA)DRB基因及血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性与新疆维吾尔族人自然长寿的关系。方法研究样本分为4组:第1组年龄≥100岁;第2组年龄为90～99岁;第3组年龄为70～90岁;第4组为65～70岁自然死亡者。分别应用聚合酶链反应序列特异引物法(PCRSSP)、单链构象多态性(SSCP)分析和直接测序技术对各组进行基因分型。结果百岁组HLADR1的频率明显高于对照组(分别为9.5%和1.9%,P<0.05);HLADR6(14)的频率也明显高于对照组(分别为9.5%和0.9%,P<0.05);HLADR6的频率明显高于其余3组;HLADR4的频率明显低于对照组(分别为9.5%和23.6%,P<0.05);HLADR9的频率明显低于对照组(分别为1.2%和9.4%,P<0.05)。相关分析显示:HLADR1及ACE基因的D等位基因与长寿呈正相关,而HLADR9呈负相关。结论HLADRB基因的DR1等位基因和ACE基因的等位基因D对长寿可能有保护作用;HLADRB基因的DR9等位基因可能是不利于长寿的危险因素,HLADRB基因多态性和ACE基因多态性相互作用对长寿有协同作用。