平颏海蛇毒腺cDNA表达文库的构建

以真核表达载体质粒pcDNA3为载体 ,成功构建了一个高质量的平颏海蛇毒腺cDNA表达文库 ,这是国内首个海蛇cDNA文库 .通过对亚文库克隆的大规模序列测定和分析 ,发现了 38个海蛇新基因序列 ,其中包括神经毒素基因、磷酸脂酶A2 基因和半胱氨酸丰富毒蛋白基因共 10个编码海蛇毒素蛋白的新基因 .

广西沿海平颏海蛇和青环海蛇化学成分分析

通过建立小鼠急性肝损伤及大鼠慢性肝损伤模型，观察并研究海洋药物Ｊ－ ９１１对小鼠急性肝损伤及大鼠慢性肝损伤的保护作用。结果表明，Ｊ－９１１能明显降低Ｄ－半乳糖胺引起急性肝损伤小鼠的血清ＡＬＴ升高和四氯化碳引起的急性肝损伤小鼠的血清ＡＬＴ、ＡＳＴ的升高，明显减轻模型肝组织病理损伤。Ｊ－９１１还可显著降低肝纤维化大鼠血清ＡＬＴ、ＡＳＴ水平及肝组织羟脯氨酸含量，并明显减轻肝组织病理损伤。说明Ｊ－９１１对实验性肝损伤具有保护作用。

平颏海蛇碱性磷脂酶A_2的融合表达、纯化及活性特征

将编码平颏海蛇碱性磷脂酶A2 的基因 (PLA2 9)克隆于硫氧还蛋白基因融合表达载体pPETTRX的trxA基因的 3′末端 ,构建符合读码框的融合基因 .2 5℃下经IPTG诱导 ,该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达 ,表达量达 2 0 %以上 .利用金属螯合亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化 ,得到纯度 85%的融合蛋白 .经肠激酶切割和离子交换柱层析进一步纯化后 ,得到浓度 95%以上的成熟PLA2 9.对重组PLA2 9进行了Western印迹检测 .重组PLA2 9具有与天然PLA2 相近的酶活性 ;并具有对HL60等几种肿瘤细胞的细胞毒作用 ,这在海蛇PLA2 中是首次报道 .平颏海蛇碱性PLA2 融合表达及快速纯化系统的建立 。

平颏海蛇的化学成分研究

本文主要研究平颏海蛇干体的化学成分及其抗氧化活性。采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、重结晶等方法进行分离纯化,从平颏海蛇干体中分离得到7个化合物,根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构分别为:胆甾醇(1)、5,6β-Epoxysitosteryl oleate(2)、9-Octadecenoic acid(9Z)-,(2R)-2,3-bis[(1-oxooctadecyl)oxy]propyl ester(3)、1-甲基海因(4)、α-棕榈酸甘油酯(5)、鲛肝醇(6)、7α-甲氧基-β-谷甾醇(7)。其中化合物2、3、5、6、7为首次从平颏海蛇中分离得到。采用DPPH自由基清除试验评价化合物的抗氧化活性,结果表明7个化合物几乎无抗氧化活性。

广西沿海平颏海蛇和青环海蛇提取物的药效学研究

目的观察广西沿海平颏海蛇和青环海蛇(1∶1)提取物的主要药效学作用。方法采用佐剂致大鼠关节炎、巴豆油致小鼠耳肿胀、醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高及棉球致大鼠肉芽组织增生、醋酸致小鼠疼痛等模型,观察广西沿海平颏海蛇和青环海蛇(1∶1)提取物的药效学作用。结果广西沿海平颏海蛇和青环海蛇提取物能明显抑制佐剂致大鼠关节炎、亦能明显抑制巴豆油所致的小鼠耳肿胀和醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高,对棉球致大鼠肉芽组织增生有明显抑制作用,并有显著的镇痛作用。结论广西沿海平颏海蛇和青环海蛇提取物具有抗风湿、抗炎、镇痛作用。

平颏海蛇CRVP基因全长cDNA片段的克隆和序列分析

通过对平颏海蛇毒腺ｃＤＮＡ文库的随机恻序和 ＰＣＲ筛选，克隆得到两种分别长为 １３０９和 １３０７ｂｐ的编码半胱氨酸丰富毒蛋白（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｖｅｎｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＶＰ）的全长 ｃＤＮＡ序列．这两种ｃｒｖｐ基因同源性为９７％，分别编码２３８和１９９个氢基酸残基，其中包括一段相同的由１９个氨基酸残基组成的信号肽．氨基酸序列分析表明，这两种ＣＲＶＰ蛋白与蜥蜴ｈｅｌｏｔｈｅｒｍｉｎｅ毒素蛋白以及台湾饭铲情ＣＲＶＰ毒蛋白高度同源，而且具有半胱氨酸丰富分泌蛋白（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＩＳＰ）家族的典型结构特征．

重组平颏海蛇磷脂酶A_2抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的观察重组平颏海蛇磷脂酶A2(rPLA2)对晚期糖基化终产物(AGEs)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。方法体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。结果与对照组相比,AGEs对VSM-Cs增殖具有明显的刺激作用(P<0.05)。在AGEs刺激下,rPLA2可明显抑制VSMCs的生长(0.753±0.098 vs. 1.100±0.226, P<0.05)。结论rPLA2可抑制晚期糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖。

平颏海蛇毒的毒理学研究

用CM-sephadex C-50柱层析,醋酸铵缓冲液洗脱,从平颏海蛇(Lapemis hardwickii)毒腺提取物中分得15个蛋白组分。其中2个有磷脂酶A_2活性,用免疫学方法证实为肌肉毒组分。其中10个是能作用于突触后膜的神经毒组分。肌肉毒的蛋白质含量约占粗毒蛋白质总量的32.2％。神经毒的蛋白质含量约占粗毒蛋白质总量的52.3％。神经毒的毒性比肌肉毒的毒性强。这些结果提示,平颏海蛇毒有肌肉毒和神经毒两种。神经毒是平颏海蛇毒的主要毒性成分。

平颏海蛇PLA_2在大肠杆菌中的融合表达

将编码平颏海蛇磷脂酶A2 的基因 (PLA2 9)分别克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pThioHisC和pTRX的HP trxA和trxA基因的 3′末端 ,构建符合读码框的融合表达载体pThioHisC PLA2 和pTRX PLA2 。 2 5℃下经IPTG诱导 ,PLA2 融合蛋白在两种原核系统中均能获得较高表达 ,但PLA2 在pTRX系统下的表达量和蛋白溶解性优于pThioHisC系统。将两种系统下的表达产物进行金属螯合亲和层析纯化 ,Trx PLA2 融合蛋白的纯度可达 85 %以上 ,而HP Trx PLA2 不表现出对介质的亲和性 ,难以得到纯化。由此 ,将pTRX PLA2 载体系统确立为进一步大量表达和纯化的载体系统。

重组海葵溶细胞素及平颏海蛇磷脂酶A_2对血管外膜成纤维细胞增殖的影响

目的观察重组海葵溶细胞素(rSrc)及平颏海蛇磷脂酶A2(rPLA2)对成纤维细胞增殖的影响。方法体外培养成纤维细胞,应用不同浓度的rSrc和rPLA2分别进行作用并设立对照进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定成纤维细胞的增殖状态。结果各组细胞增殖率分别为:对照组0.840±0.061、rSrc 100 μg/ml组0.263±0.044、rSrc 10 μg/ml组0.418±0.054、rSrc 1 μg/ml组0.605±0.063、rSrc 100 ng/ml组0.772±0.054、rSrc 10 ng/ml组0.906±0.072、rPLA2 100 μg/ml组0.498±0.076、rPLA2 10 μg/ml组0.937±0.112、rPLA2 1 μg/ml组0.978±0.145。统计分析显示,低至1 μg/ml的rSrc仍能明显抑制大鼠成纤维细胞的增殖(P<0.01),并呈现剂量依赖性(P<0.05)。rPLA2 100 μg/ml组与对照组相比细胞增殖率有显著差异(P<0.05);rPLA2 10 μg/ml和rPLA2 1 μg/ml组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。结论rSrc和rPLA2分别对血管外膜成纤维细胞增殖有一定的抑制作用。

平颏海蛇毒7种毒素的分离及其性质研究

用葡聚糖凝胶G-75和羧甲基纤维素CM52柱层析,自北部湾平颏海蛇(Lapemis hardwickii)粗毒分离出7种毒素,分别命名为平颏海蛇毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ。这些毒素对每千克小白鼠的LD_(50)分别为1.82×10^(-7)、0.66×10^(-7)、0.40×10^(-7)、0.67×10^(-7)、0.47×10^(-7)、1.46×10^(-7)和0.70×10^(-7)kg。凝胶柱等电聚焦测定其pI分别为9.74、10.1、9.84、9.70、9.59、9.63和9.52。凝胶过滤测定的分子量分别为6 839、6 777、8 239、8 366、6 372、7 501和6 551,氨基酸组成计算毒素Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ的分子量分别为7 033、7 525、6 929和7 037。每种毒素在280nm波长处均有典型的蛋白吸收峰,其消光系数分别为2.136、2.076、0.986、1.726、1.130、1.786和1.342。毒素Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ分别由65、67、61和62个氨基酸残基组成。这7种毒素都是未曾被研究过的。

平颏海蛇神经毒组分Ⅷ的分离纯化及毒理的初步研究

平颏海蛇毒腺提取物用CM-Sephadex C25柱层析,经醋酸铵缓冲液梯度洗脱,获得19个蛋白组分。经离体小鸡颈二腹肌标本检验,其中14个具有突触后神经毒作用。组分XⅡ再经Sephadex G 50和CM-Sephadex C 50层析纯化后得到组分XⅢ-2-4,该组分用Sephadex G 50过滤呈单一蛋白吸收峰,经三种不同类型的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为电泳纯蛋白。其等电点为8.3,表观分子量为8200。小鼠ipLD_(50)为94μg/kg(86～102μg/kg)。其对小鸡颈二腹肌标本的神经肌肉传导的阻断作用经反复冲洗360min,结果表明是难于逆转的。根据氨基酸组成分析、分子量测定以及对神经肌肉传导阻断的难逆转结果,推测平颏海蛇神经毒素XⅢ-2-4可能属于突触后长链神经毒。

抗平颏海蛇短链神经毒素全人源单克隆抗体的筛选、制备及生物活性研究

目的重组表达3种平颏海蛇短链神经毒素,利用噬菌体抗体库筛选制备全人源抗毒素单克隆抗体并评估其生物活性。方法以重组表达纯化的神经毒素蛋白作为抗原,从自主构建的噬菌体抗体库中筛选获得噬菌体抗体,经序列测定确定其抗体类型后构建完整抗体。利用真核表达系统表达纯化抗体后鉴定其抗原结合活性、生化特性及药代动力学特性。在体内验证抗体药物的抗毒素作用。结果经过4轮筛选,获得2株能同时结合3种神经毒素的噬菌体单链抗体,并将其制备成完整的抗体,进一步证实所获得的抗体可特异性结合3种抗原。2株全人源抗体均可拮抗神经毒素对昆明小鼠的致死作用。结论利用重组神经毒素和噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗平颏海蛇短链神经毒素的全人源治疗性抗体。

平颏海蛇毒鼠源单链抗体噬菌体展示文库的构建

为了研发新型小分子类抗海蛇毒药物,本研究利用平颏海蛇(Hydrophis curtus)毒免疫成年小鼠,使其产生免疫应答,以小鼠的脾脏总RNA为基础,反转录构建cDNA文库,分别扩增抗体轻链和重链可变区片段并通过重叠延伸PCR技术构建平颏海蛇毒小鼠单链抗体基因.构建完成后,该基因随后被成功重组至噬菌体,并利用大肠杆菌原核表达系统建立了单链抗体噬菌体展示文库.经多轮富集后,最终获得弱阳性克隆.本研究获得了一套构建平颏海蛇毒鼠源单链抗体噬菌体文库并筛选阳性克隆的方案.

平颏海蛇蛇毒磷脂酶A_2的纯化及性质(英文)

前文报导平頦海蛇L.handwickii的毒液含有丰富的磷脂酶A_2(PLA_2,EC3.1.1.4)现采用sephadex G—75凝胶过滤,CM—纤维素及DEAE—纤维素柱层析等步骤,将此酶提纯至SDS —PAGE电泳中仅显一条区带并测出其相应分子量为12000,在聚丙烯酰胺凝胶IBF中测得此酶PI为5.5,氨基酸组份分析结果表明酶分子中含有较多的半胱氨酸和门冬氨酸残基。此酶水解卵磷脂的产物经TLC鉴定为溶血卵磷脂,平颌海蛇蛇毒PLA_2在pH5.0～8.0范围稳定,最适pH为7.0;在pH6.0条件下,经90℃保温10min仍保持大部价活力,此酶可被Ca^(2+),Na^+,Mg^(2+)等阳离子激活,而受EDTA—Na_2,Zn^(3+),Cu^(2+)和柠檬酸、草酸等阴离子抑制。通过紫外吸收光谱及喇曼光谱的观察,初步研究了此酶的分子构型及某些基团的性质,最后,对已被研究的三种海蛇(平頦海蛇和L.Semifa—rciata及E.Schistosa)的PLA_2的某些性质进行了比较并作了简单的讨论。

两种国产海蛇排毒量的种间差异及形态相关性

以青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)和平颏海蛇(Hydrophis curtus)为实验对象,探讨2种海蛇排毒量的种间差异及与形态特征的关系。研究结果显示,2种海蛇头体长(SVL)频次分布均符合正态分布且无显著性别差异,青环海蛇的SVL大于平颏海蛇。雄性青环海蛇的尾长(TL)显著大于雌性,而头长(HL)和头宽(HW)无性别差异;雌性平颏海蛇的HW显著大于雄性,而TL和HL无性别差异。2种海蛇的TL、HL和HW存在显著的种间差异。青环海蛇雌性和雄性排毒量的鲜质量、干质量和干物质含量分别为43.18 mg和33.36 mg、9.14 mg和8.05 mg、21.51%和25.01%,平颏海蛇雌性和雄性排毒量的鲜质量、干质量和干物质含量分别为33.16 mg和34.71 mg、4.40 mg和5.30 mg、13.30%和15.05%。2种海蛇排毒量的鲜质量、干质量和干物质含量无性别差异。2种海蛇的SVL、HL与排毒量鲜质量、干质量存在显著的正相关;青环海蛇HW与排毒量鲜质量存在正相关,但与干质量无显著性相关;平颏海蛇HW与排毒量鲜质量无关,但与干质量呈负相关;2种海蛇SVL、HL与干物质含量无关,但HW与干质量呈负相关。2种海蛇排毒量鲜质量、干质量和干物质含量存在显著的种间差异。本研究初步阐明了2种海蛇的排毒量特征及其形态相关性,为海蛇咬伤的临床诊疗、抗海蛇毒血清的研制及蛇毒天然活性药物的开发提供参考。

平颏海蛇化学成分的研究Ⅱ

目的研究平颏海蛇干体的化学成分。方法采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、重结晶等方法进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果从平颏海蛇干体中分离得到10个化合物,分别鉴定为:棕榈酸(1),油酸甲酯(2),油酸(3),3-methoxycholest-5-ene(4),Stigmasta-5,24(28)-diene,3-methoxy-,(3β,24E)(5),Tetracosanamide,N-[(1S,2R,3E)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-3,7-heptadecadien-1-yl](6),5α-Cholestan-3β-ol,5,6β-dibromo-,nonanoate(7),Cholestane-3,5,6-triol,3-nonanoate(8),胆甾-5-烯-3β,7β-二醇(9),胆甾-5-烯-3β,7α-二醇(10)。结论所有化合物均为首次从平颏海蛇中分离得到。

平颏海蛇皮中新型硫酸皮肤素的分离纯化和结构表征

目的从平颏海蛇皮中提取分离糖胺聚糖(GAGs),并对其结构进行初步表征。方法对海蛇皮进行脱脂处理后,采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶联合酶解提取粗多糖,采用氯代十六烷基吡啶(CPC)沉淀和Q-Sepharose Fast Flow离子交换树脂对粗多糖进行分离纯化。运用醋酸纤维素薄膜电泳分析其GAGs种类,采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生高效液相色谱(HPLC)法分析其单糖组成,利用硫酸软骨素酶降解结合质谱和强阴离子交换色谱(SAX-HPLC)法分析其二糖组成。结果获得了2种GAGs纯化组分,并对其中1种含量较高的纯化组分(HSAP-2)进行了初步结构表征。HSAP-2中含有4种二糖,主要为单硫酸化二糖(4S和6S);单糖组成中含有艾杜糖醛酸(IdoA)、葡萄糖醛酸(GlcA)和乙酰氨基半乳糖(GalNAc);是1种高度杂合的新型硫酸皮肤素(DS)。结论从平颏海蛇皮中分离纯化获得了1种结构新颖的DS,为平颏海蛇多糖结构与生物活性的深入研究提供了基础。