狄斯瓦螨VdesNPC2b蛋白的基因克隆、原核表达及其与寄主幼虫信息素结合机制研究

【目的】研究狄斯瓦螨Varroa destructor尼曼匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 protein,NPC2)VdesNPC2b与狄斯瓦螨寄主蜜蜂幼虫信息素油酸甲酯和β-罗勒烯的结合特性和机制,阐明VdesNPC2b在狄斯瓦螨寄主识别中的功能,为狄斯瓦螨生物防治提供理论依据。【方法】扩增狄斯瓦螨VdesNPC2b开放读码框(ORF)并进行生物信息学分析;基于pET-30a质粒构建原核表达载体,通过原核表达和亲和层析获得VdesNPC2b重组蛋白。利用荧光竞争结合实验检测VdesNPC2b与蜜蜂幼虫信息素油酸甲酯和β-罗勒烯的结合力,并通过荧光光谱变温实验测定22和32℃下VdesNPC2b与油酸甲酯和β-罗勒烯结合力变化来分析结合机制。采用SWISS-MODLE软件对VdesNPC2b进行同源建模,采用MVD软件对VdesNPC2b和β-罗勒烯进行分子对接模拟,初步分析VdesNPC2b与β-罗勒烯结合的关键氨基酸位点。【结果】VdesNPC2b(GenBank登录号:OR463903)的ORF全长531 bp,编码176个氨基酸,VdesNPC2b N端有一个16个氨基酸残基的信号肽。荧光竞争结合试验结果显示,VdesNPC2b与油酸甲酯和β-罗勒烯解离常数KD值分别为2.89和3.49μmol/L,结合过程为动态猝灭,维持VdesNPC2b与油酸甲酯和β-罗勒烯的相互作用力为疏水作用力。同源建模显示VdesNPC2b的二级结构主要为β-折叠,内部存在1个潜在的配基结合腔,VdesNPC2b与β-罗勒烯结合的关键氨基酸位点是Leu68,Ile103和Phe107等。【结论】狄斯瓦螨通过VdesNPC2b结合寄主蜜蜂幼虫长链酯类信息素油酸甲酯和挥发性的β-罗勒烯协同进行宿主定位和识别。

幼虫信息素中三种酯类对中华蜜蜂工蜂发育和采集行为的影响

为研究中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫信息素中的3种酯类成分(甲基棕榈酸酯、乙基棕榈酸酯和乙基油酸酯)对其工蜂发育和采集行为的影响,取1日龄工蜂喂食不同食物,把喂食食物(炼糖)中添加0.1%或1%(w/w)某种酯类的工蜂组作为处理组,以喂食食物(炼糖)中不添加酯类(0%)的工蜂组作为对照组,然后测定7日龄、14日龄工蜂的卵巢发育和3,5,7,12,18和21日龄工蜂王浆腺的宽度,以及工蜂首次参加采集的日龄。结果表明:(1)在无王群中,甲基棕榈酸酯两处理组(1%,0.1%)的7日龄和14日龄工蜂卵巢发育率都显著低于对照组;在无王群中,0.1%乙基棕榈酸酯处理组的14日龄工蜂卵巢发育率极显著低于对照组;在有王群中,1%甲基棕榈酸酯处理组和乙基油酸酯两处理组的14日龄工蜂卵巢发育都显著低于对照组;(2)在有王群中,甲基棕榈酸酯两处理组的5日龄和7日龄工蜂王浆腺宽度显著大于对照组,12,18,21日龄工蜂王浆腺宽度极显著小于对照组;乙基油酸酯两处理组的7～21日龄工蜂王浆腺宽度显著小于对照组;(3)3种酯类,只有甲基棕榈酸酯处理组的工蜂首次采集日龄显著大于对照组。这些结果说明,不同蜜蜂幼虫信息素对中华蜜蜂工蜂发育和采集行为具有不同的生物学效应。

幼虫信息素酯类混合物对中华蜜蜂育王质量的影响

【目的】基于免移虫育王技术,探究幼虫信息素酯类混合物在育王中对中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂王质量的影响,为优质蜂王的培育奠定基础。【方法】利用中华蜜蜂免移虫育王生产器培育蜂王,在幼虫60-64 h时向王台内注入1μL不同酯类组成的混合物(酯类混和物的浓度梯度分别为0,0.1%,1.0%和10.0%),待蜂王出房后测定蜂王初生重、胸重、胸宽以及单侧卵巢管数量;并利用荧光定量PCR测定蜂王卵巢卵黄原蛋白基因Vitellogenin(Vg),昆虫储存蛋白基因hexamerin70b(hex70b)和hexamerin110(hex110)的表达量。【结果】免移虫育王过程中添加3种信息素酯类混合物3E(1.0%甲基亚油酸酯、16.0%甲基亚麻酸酯和35.0%甲基油酸酯),不同浓度处理时蜂王的初生重较对照(石蜡油)均显著增加,但蜂王胸宽和胸重均无显著变化;0.1%和1.0%浓度处理组蜂王单侧卵巢管数显著增加;不同浓度处理组Vg和hex70b的表达量均无显著变化,但1.0%和10.0%浓度处理组蜂王卵巢的hex110表达量显著升高。4种信息素酯类混合物4E(4.5%甲基棕榈酸酯、1.0%甲基亚油酸酯、16.0%甲基亚麻酸酯和35.0%甲基油酸酯)试验组只有10.0%浓度处理组蜂王的初生重和单侧卵巢管数较对照显著上升(P<0.05),0.1%和1.0%浓度处理对蜂王的个体发育指标均无显著影响(P>0.05);0.1%和1.0%浓度处理组Vg的表达量、10.0%浓度处理组hex70b的表达量以及1.0%和10.0%浓度处理组hex110的表达量均显著上升(P<0.05)。10种信息素酯类混合物10E(4.5%甲基棕榈酸酯、2.5%甲基硬脂酸、35.0%甲基油酸酯、1.0%甲基亚油酸酯、16.0%甲基亚麻酸酯、3.5%乙基棕榈酸酯、1.5%乙基硬脂酸酯、18.0%乙基油酸酯、0.5%乙基亚油酸酯和17.5%乙基亚麻酸酯)试验组,各个浓度处理蜂王的初生重以及Vg和hex110的表达量均显著下降(P<0.05),但蜂王的单侧卵巢管数和胸部指标无显著变化(P>0.05),10.0%浓度处理时hex70b的表达量也显著降低(P<0.05)。【结论】中华蜜蜂育王过程中添加1.0%的3E和10.0%的4E幼虫信息素酯类可以在一定程度上提高蜂王质量。

中华蜜蜂幼虫信息素鉴定

【目的】分析鉴定中华蜜蜂(Apis cerana cerana)幼虫是否含有与西方蜜蜂(Apis mellifera)幼虫相同的幼虫利它素和信息素及其在不同日龄阶段幼虫的分布情况。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,取2日龄、6日龄(即将封盖)和7日龄(封盖后)的工蜂幼虫及2日龄、7日龄(即将封盖)和8日龄(封盖后)的雄蜂幼虫,经过正己烷浸泡碾碎,取上清液并进行层析过柱分离,应用气相色谱来研究中华蜜蜂幼虫利它素和信息素。【结果】本研究首次发现中华蜜蜂幼虫信息素含有甲基棕榈酸酯(MP)、甲基油酸酯((MO)、甲基硬脂酸酯(MS)、甲基亚油酸酯(ML)、甲基亚麻酸酯(MN)、乙基棕榈酸酯(EP)、乙基油酸酯(EO)、乙基硬脂酸酯(ES)、乙基亚油酸酯(EL)和乙基亚麻酸酯(EN)。【结论】中华蜜蜂幼虫含有与西方蜜蜂幼虫相同的幼虫利它素和10种脂肪类信息素,但这两种蜜蜂信息素的含量及在不同日龄幼虫分布规律不同。

蜜蜂幼虫信息素在工蜂体表的分布

通过气相色谱分析幼虫信息素的10种酯类在中蜂和意蜂成年工蜂的分布情况。将成熟的封盖子脾提至人工培养箱中孵化,幼蜂出房时对其进行标记,再放回原群中。取刚出房幼蜂、10日龄和20日龄这三种工蜂的头部、胸部和腹部样品,用于气相分析。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂个体主要含有甲基亚油酸酯(ML)、乙基亚油酸酯(EL)、甲基亚麻酸酯(MN)和乙基亚麻酸酯(EN),这些酯类在工蜂各节分布情况不一。

意大利蜜蜂幼虫信息素浓度对PKA、NOS、PLC活性的影响

为了了解幼虫信息素对蜜蜂采集行为的影响及不同酶在蜜蜂采集过程中所发挥的作用,该文分析了不同浓度幼虫信息素处理后的采集蜂在出巢与携粉归巢两个阶段的蛋白激酶A、一氧化氮合成酶和磷脂酶C活性的变化,发现蛋白激酶A的酶活表现为携粉归巢阶段显著高于出巢阶段,出巢阶段800单位幼虫信息素处理后的蜂PKA活性显著高于对照,但与400单位幼虫信息素处理差异不显著,携粉归巢时800单位幼虫信息素处理组的PKA活性显著高于400单位幼虫信息素处理;NOS和PLC活性在出巢、携粉阶段及各处理间均无显著差异.适当浓度的幼虫信息素处理可以刺激蛋白激酶A信号转导通路,使其酶活性增加,来保证能量的充分供应和代谢机能的正常运转.但不会增加NOS和PLC活性.通过对蜜蜂出巢和携粉归巢时蛋白激酶A、一氧化氮合成酶以及磷脂酶C的研究,可为进一步研究蜜蜂的行为机制提供理论依据.

幼虫信息素中三种酯类对中华蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂哺育和封盖行为以及蜂王发育影响

为研究蜜蜂幼虫信息素中3种酯类成分(甲基棕榈酸酯、乙基棕榈酸酯和乙基油酸酯)对中华蜜蜂Apiscerana cerana和意大利蜜蜂Apismellifera ligustica工蜂哺育行为、封盖行为以及蜂王发育影响,在人造蜂蜡王台中加入1%和0.1%(w/w)的3种酯类作为实验组,以不添加酯类(0%)的为对照组,移入1日龄工蜂幼虫,测定王台接受率、单个王台中幼虫和王浆重量;另将分别添加1%和0.1%(w/w)3种酯类的石蜡假幼虫放入工蜂巢房中,同样设对照组,测定假幼虫的封盖率;在新鲜王浆中以1%和0.1%(w/w)分别加入3种酯类作为实验组,以不添加酯类(0%)的作为对照组,再分别在1日龄、2日龄和3日龄幼虫王台中加入0.01mL含有酯类的蜂王浆,并测定蜂王初生重和卵巢管数量。结果表明:0.1%甲基棕榈酸酯可以显著提高中蜂和意蜂幼虫重量;意蜂的甲基棕榈酸酯和乙基油酸酯两个实验组(1.0%,0.1%)假幼虫封盖率都极显著高于对照组;乙基油酸酯两个实验组(1.0%,0.1%)都显著降低了中蜂和意蜂蜂王初生重和卵巢管数量。这说明不同蜜蜂幼虫信息素具有不同的生物学效应。

蜜蜂蜂王信息素研究进展

综述了蜂王信息素的化学组成、特性、作用 ,以及与幼虫信息相互关系的研究进展 ,对蜂王信息素在养蜂和植物授粉中的应用做了介绍。西方蜜蜂的蜂王上颚腺信息素 (queen’smandibularglandpheromone,QMP)。QMP包含了 5种成分 :(E) -9-氧 -2 -癸烯酸 ( 9 ODA)、(R ,E) ( ) 和 (S,E) ( +) 9 羟基 -2 -癸烯酸 ( -9 HDA和 +9 HDA)、甲基p -羟基安息香酸盐 (HOB)、4-羟基 -3 -甲氧苯乙醇 (也称香草醇 ,HVA) ,9 ODA是其中最重要的成分 ;QMP的组分与蜜蜂的进化程度有关 ,进化程度越高则组分越复杂 ;QMP通过抑制保幼激素的产生来调节青年工蜂的个体发育。

不同处理方式对蜜蜂采集大豆花粉的影响

为增加蜜蜂访问大豆花的积极性,提高杂交大豆的结荚率,利用巢内悬挂幼虫信息素和饲喂8-Br-c GMP、豆花糖浆处理蜂群,对照组为饲喂糖浆(1:1)的蜂群。采用收集花粉、摄像观察和荧光定量的方法,对3种处理蜂群的花粉重量、采集蜂数量和Amfor和Ammvl的m RNA相对表达量进行比较。采用浓度梯度筛选出的400 LEqu幼虫信息素和0.5 mg/L 8-Br-c GMP、豆花糖浆处理蜂群,对照组大豆花粉重量百分比为3.05%,3个处理组分别为10.42%、8.53%和5.99%,400 LEqu幼虫信息素、0.5 mg/L 8-Brc GMP与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。采集大豆花粉的蜜蜂数量百分比,对照组为55.09%,3个处理组均高于对照组,处理组之间均不存在显著差异(P>0.05)。3种处理方式均可以提高蜜蜂采集大豆花粉的积极性,提高采粉蜂的数量,增加访问大豆花的机率。

蜜蜂E-β-罗勒烯的研究进展

蜜蜂是真社会性昆虫,蜂群内部各成员之间分工明确,但又紧密合作,共同维系蜂群结构与功能,这离不开三型蜂之间高效的信息传递。蜂群内部的信息传递主要是通过化学通讯即蜜蜂信息素来相互传递,蜜蜂幼虫信息素是其中一个重要的蜜蜂信息。近年来,研究人员探索发现,E-β-罗勒烯是一种新发现的蜜蜂幼虫信息素组分,它不仅能够抑制蜜蜂工蜂的卵巢成熟,还参与调节工蜂的采粉行为,提高了采粉蜂的比例,增加了哺育蜂访问巢房的频率,具有一定的科研实践价值。