毒力基因序列变异对幽门螺杆菌毒力的影响

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种常见细菌,H.pylori感染已经被证实为胃癌的高危因素。世界上约50%人口感染了H.pylori。然而,最终只有2%~3%的H.pylori感染者会患上胃癌。不同的疾病结局是由细菌、宿主和环境因素之间复杂的相互作用所介导的。过去20年里,通过对宿主和细菌因素的研究,提高了对H.pylori发病机制的认识。这些研究包括确定不同的毒力因子序列变异对H.pylori致病的影响及其与不同疾病结局的关联,特别是细菌黏附素、细胞毒素和空泡毒素等。

海南省39株幽门螺杆菌的耐药性及毒力基因特征

目的了解海南省幽门螺杆菌(Hp)耐药性及其毒力基因vacA、cagA和iceA基因型特征。方法对146例上消化道症状疾病患者进行胃镜检查,取胃黏膜组织进行Hp的分离和培养,对Hp进行药敏检测;通过聚合酶链式反应(PCR)对毒力基因cagA、vacA和iceA进行检测和分型,cagA测序进行聚类分析、并构建系统进化树;使用Fisher确切概率法分析各型毒力基因和患者疾病发生的相关性。结果共培养出39株Hp,对阿莫西林和克拉霉素的耐药率分别为2.6%和48.7%;39株均为vacA^(+)菌株,iceA 1型26株、2型13株;33株为cagA^(+)菌株,其中5株为西方型(EPIYA-ABC型),28株为东亚型(EPIYA-ABD型);cagA^(+)和vacA^(+)菌株与胃和十二指肠疾病有显著的相关性(P<0.05),iceA则无显著性差异(P>0.05)。结论海南省胃和十二指肠Hp患者中Hp毒力基因多样化,vacA s1am2/cagA^(+)基因型在消化性溃疡患者中占优势,不同毒力基因型对胃和十二指肠疾病的发生具有明显的差别,阿莫西林可作为该地区根除Hp首选抗生素。

黔南州和贵阳市幽门螺杆菌临床菌株的耐药性、基因多样性及其与疾病的关系

目的了解贵州省贵阳市和黔南州少数民族地区幽门螺杆菌的耐药性、基因多样性及其与临床疾病的关系。方法通过内窥镜采集样本分离培养幽门螺杆菌,测定耐药性和基因型特征,比较不同地区、疾病类型的差异,分析幽门螺杆菌结构特点及黔南州幽门螺杆菌不同菌型混合感染情况。结果两地区cagA可变区EPYIA分型构成比差异有统计学意义(P=0.012),vacA基因型构成比差异有统计学意义(P=0.000);MLST方法得到两地区幽门螺杆菌菌株94.6%(53/56)新的序列型。黔南州幽门螺杆菌不同菌型菌株混合感染率为44.4%,不同临床疾病的幽门螺杆菌不同菌型混合感染构成比差异无统计学意义(P=0.349)。结论黔南州和贵阳市两地区幽门螺杆菌cagA可变区EPIYA分型和vacA基因型构成比存在差异。

幽门螺杆菌katA基因功能及其在耐受氧化损伤中的作用分析

【目的】过氧化氢酶(KatA)是幽门螺杆菌编码的重要毒力因子,在抵抗宿主免疫杀伤和疫苗研发等方面具有重要功能。为了鉴定幽门螺杆菌KatA的酶学特性,并分析其在幽门螺杆菌氧化耐受中的功能。【方法】首先,从幽门螺杆菌临床耐药菌株Hp_G272基因组中分离katA基因,并在大肠杆菌中克隆表达、分离纯化KatA^(G272)蛋白;然后,利用CAT检测试剂盒体外分析KatA^(G272)的过氧化氢酶活性;其次,利用同源重组技术构建katA基因工程菌株,包括敲除菌株和回补菌株;最后,通过比较野生菌株与工程菌株生长表型差异、分解过氧化氢能力差异及耐受过氧化氢能力差异,阐述katA基因的功能及其在幽门螺杆菌耐受氧化损伤中的作用。【结果】在大肠杆菌中成功克隆表达并分离纯化KatA^(G272),体外酶学分析表明,KatA^(G272)是一类嗜酸性过氧化氢酶,基因敲除分析表明,敲除该基因幽门螺杆菌丧失分解和耐受过氧化氢的能力,而回补该基因幽门螺杆菌回复分解和耐受过氧化氢的能力。【结论】katA基因是幽门螺杆菌分解和耐受过氧化氢的唯一功能基因,在幽门螺杆菌氧化耐受中具有重要功能。

幽门螺杆菌毒力因子及其诱发胃癌作用机制研究进展

幽门螺杆菌(Hp)属于革兰阴性菌,可以在人胃内存活并定植。Hp能够利用其毒力因子调节宿主炎症反应,破坏胃黏膜,其感染的长期结局包括胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等恶性肿瘤,是与胃癌相关的Ⅰ类致癌物。与Hp生存相关的毒力因子主要是脲酶,在脲酶的帮助下,Hp可以在pH值极低的胃内生存,形成持久感染;与Hp定植相关的毒力因子包括外部炎症蛋白A、Hp外膜蛋白Q、血型抗原结合黏附素,这些毒力因子与宿主胃上皮细胞相互作用,帮助Hp在胃黏膜定植,增加癌前病变及胃癌发生风险;与Hp致病相关的毒力因子包括细胞毒素相关基因A、空泡细胞毒素、外膜囊泡、γ-谷氨酰转肽酶、高温需求蛋白A等,Hp在胃上皮细胞存活、黏附并成功定植后,上述毒力因子进一步诱导炎症反应,促进细胞增殖、侵袭和转移,促使胃部炎症向胃癌转化。深入研究Hp毒力因子诱导胃癌发生的机制,有助于为胃癌的诊断和治疗提供新思路和方法。

幽门螺杆菌诱导上皮-间质转化在胃癌中的作用机制

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种单极、微需氧、多鞭毛、螺旋形的革兰氏阴性菌,可在人胃黏膜上存活并定植。Hp作为与胃癌相关的Ⅰ类致癌物,其对胃黏膜的长期刺激可导致萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等多种疾病。研究表明,Hp感染可诱导胃上皮细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),而EMT的异常调控则会导致胃癌发生。本文就Hp诱导胃上皮细胞发生EMT致胃癌的相关机制研究展开综述,为胃癌的早期诊断和靶向治疗提供新思路。

幽门螺杆菌东亚型菌株GZ7/cagA^(+)和GZ7/ΔcagA源外膜囊泡的蛋白组学比较

目的通过分离、鉴定和比较细胞毒素相关基因A蛋白(cagA)、阳性幽门螺杆菌(H.pylori)、东亚型菌株GZ7/cagA^(+)及其cagA敲除菌株GZ7/ΔcagA来源的外膜囊泡(OMVs)中的差异表达蛋白(DEPs),分析cagA基因对OMVs中蛋白表达的影响。方法采用超速离心法分别提取GZ7/ΔcagA和GZ7/cagA^(+)的OMVs,通过透射电镜和纳米颗粒追踪技术鉴定其形态和粒径,使用Western blot技术验证两组OMVs中cagA蛋白的表达,分析OMVs的蛋白质组学;对蛋白组学数据进行质控分析和主成分分析鉴定后,以上调蛋白倍数变化(FC)>2.0、下调蛋白FC<0.5,FDR≤0.05为筛选条件筛选DEPs,利用OmicsBean在线工具、Gene Ontology和KOBAS对DEPs进行生物信息学分析;采用免疫荧光鉴定OMVs细胞在细胞中的定位,实时无标记细胞分析仪检测细胞活性。结果通过电镜和粒径证实成功分离纯化了OMVs;蛋白质组分析发现,GZ7/cagA^(+)-OMVs组与GZ7/ΔcagA-OMVs组比较有79个DEPs,其中38个蛋白下调、41个蛋白上调;生物信息学分析显示,DEPs主要与丙酮酸代谢、丙酸代谢、糖酵解/糖异生及柠檬酸循环等代谢途径有关;免疫荧光和实时无标记细胞分析证实H.pylori来源的OMVs能进入细胞并定位在线粒体并抑制细胞增殖。结论cagA能影响H.pylori分泌的OMVs中蛋白质的成分,DEPs可能促进cagA^(+)H.pylori在胃黏膜上的定植及致病性。

幽门螺杆菌临床株粘附素HpaA基因的克隆表达及在诊断中的价值

目的 构建表达幽门螺杆菌临床株粘附素 (HpaA)的重组质粒 ,在大肠杆菌中表达获得重组蛋白 ,探讨重组蛋白作为Hp抗原在感染诊断中的价值。 方法 用PCR方法从幽门螺杆菌临床株DNA中扩增HpaA基因片段。克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达 ,表达产物经纯化和Westernblot鉴定后 ,作为Hp抗原 ,ELISA法对 10 0例临床标本进行相应抗体检测 ,并与细菌培养、组织学染色和快速尿素酶试验比较来评价其应用的可行性。结果 经酶切、测序分析插入的基因片段全长 783bp ,与基因文库中的粘附素基因同源性达 98 87%。表达蛋白经SDS -PAGE分析 ,相对分子量 (Mr)约为 300 0 0 ,可溶性表达占全菌的 4 1 6 7%以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 90 %以上的重组蛋白。Westernblot证实了其免疫反应性。通过对临床病例的检测结果显示细菌培养、组织学染色、快速尿素酶试验和HpaA抗体检测的敏感性、特异性和准确性分别为 10 0 0 %和 80 9% ;10 0 0 % ;和 90 5 % ;90 5 %和 85 8% ;93 3%和 85 9% ,相差不多。结论 HpaA能在大肠杆菌中高效表达 ,具有较强的免疫反应性 ,作为检测试剂敏感性和特异性均较好 ,有望成为Hp新的非侵入性的检测方法。

表达幽门螺杆菌hpaA基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的免疫保护作用

目的 克隆幽门螺杆菌 (H pylori)全长hpaA基因 ,构建表达HpaA蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 ,并研究其对小鼠的免疫保护作用。方法 用PCR扩增全长hpaA基因 ,经适当的酶切 -连接反应将其连入原核表达质粒 pTrc99A ,并进行了基因测序。重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL32 6 1,提取重组菌质粒 ,PCR和酶切鉴定 ,筛选阳性克隆。用SDS -PAGE电泳和Westernblot进行HpaA表达分析和鉴定 ,用薄层扫描分析HpaA含量。重组菌 3× 10 8CFU/ 0 4ml/只免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,4周后H pyloriSS110 5CFU/只攻击小鼠 ,再 5周后处死小鼠 ,取腺胃做快速尿素酶试验和Giemsa染色 ,以明确H pylori定植情况 ,对照观察免疫保护效果。 结果 经PCR和酶切证实 ,构建了含 783bphpaA基因的重组原核表达质粒 pTrc99A -hpaA ,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。重组菌能表达约 30kDaHpaA蛋白 ,重组HpaA量约占全菌体蛋白量的 38 9% ,Westernblot证实其有免疫反应性。重组菌对小鼠免疫保护率为 4 3 4 8% (10 / 2 3) ,与空白对照组比统计差异显著 (P =0 0 1)。结论 构建了表达H pyloriHpaA的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 ,该菌株对C5 7BL/ 6小鼠有免疫保护作用。

幽门螺杆菌hpaA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析

目的在乳酸菌中表达幽门螺杆菌(HP)hpaA基因,口服免疫小鼠后检测其免疫原性。方法 PCR方法从基因组中扩增基因hpaA,将其克隆至表达载体pNICE:sec,将重组质粒转化乳酸菌NZ9000株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的hpaA蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。将雌性ICR(CV级)小鼠随机分为4组,分别用PBS、携带空质粒的乳酸菌、携带pNICE:sec-hpaA的乳酸菌、灭活的HP灌胃。免疫7次后检测其特异性IgG和IgA的产生。结果扩增hpaA基因并构建了重组原核表达质粒pNICE:sec-hpaA,转化乳酸菌NZ9000后经nisin诱导可表达Mr分子量约29kD的重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的9.3%,Western blot分析其能与幽门螺杆菌抗血清特异性反应,具有良好的免疫原性。携带pNICE:sec-hpaA质粒的乳酸菌刺激产生的IgG水平明显高于携带空质粒组,与灭活HP组没有明显的差异,但其刺激产生的IgA水平明显高于其它组(P<0.05)。结论表达hpaA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后,能够刺激小鼠产生特异的IgG和IgA,可作为幽门螺杆菌口服疫苗候选抗原。

幽门螺杆菌临床菌株hpaA基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆幽门螺杆菌 (Hp) hpa A基因 ,构建 hpa A基因表达载体 ,鉴定其表达的融合蛋白免疫性。方法 :采用高保真 PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株 Y0 6中扩增 hpa A基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建p ET32 a的 hpa A表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用 Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果 :所克隆的 hpa A基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 .2 5 %～ 97.32 % ,氨基酸序列同源性高达 95 .38%～ 98.4 6%。p ET32 a- hpa A- BL2 1DE3系统的Hpa A融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的 4 0 %左右。Hpa A融合蛋白能与 Hp全菌抗体发生结合反应 ,免疫家兔能获得高效价抗体。结论 :本研究成功地构建了 Hp hpa A高效表达系统 ,所表达的 Hpa A融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ,可作为 Hp疫苗的抗原。

幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的克隆及在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达

目的构建幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒,并观察其在大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌(B.bifidium)中的表达情况。方法通过PCR得到hpaA-vacA融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-hpaA-vacA,电穿孔转化入大肠杆菌BL21和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-vacA-hpaA,vacA-hpaA融合基因的分子量约为1 548 bp;经SDS-PAGE分析,在大肠杆菌中表达出85 kD的融合蛋白,表达的蛋白约占细菌总蛋白的20.5%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,但表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约8.5%。Western blotting结果确认了该条带为hpaA-vacA融合基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-hpaA-vacA能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的 克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法 采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果 所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论 成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达

目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素（HpaA）。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）总DNA中钓取hpaA结构基因，克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达，表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp，编码261个氨基酸，SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000，可溶性表达占全菌的20%以上，经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性，可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。

幽门螺杆菌基因hpaA克隆、融合表达和鉴定

目的克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA,构建幽门螺杆菌hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从H.pylori郑州分离株MEL-HP27染色体DNA上扩增出hpaA基因,序列分析后,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coliTB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果用PCR方法扩增的hpaA基因长度为783bp,编码260个氨基酸,经酶切鉴定和测序,插入到克隆载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为29kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%。结论本研究成功构建了hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础。

幽门螺杆菌vacA毒性片段与hpaA融合基因的原核表达

目的:构建幽门螺杆菌vacA毒性片段(v)与hpaA融合基因的原核表达载体,并诱导表达,为制备具有治疗与预防作用的疫苗奠定基础. 方法:通过设计带有编码IL-3N端12个氨基酸引物,用PCR技术从pQE30-V质粒扩增出有接头的v基因,克隆至质粒pTrc99A-HpaA中与hpaA融合.将融合基因插入原核表达载体pQE30,再将pQE30-V-HpaA转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果, Western blotting鉴定其抗原性. 结果:融合蛋白的相对分子量约为65 000,能与幽门螺杆菌感染的人阳性血清发生抗原抗体反应. 结论:重组表达质粒pQE30-V-HpaA表达成功,为进一步研究其免疫学活性及制备疫苗提供了材料.

基于一次性胃部细胞无创采样器的幽门螺杆菌耐药基因检测及其临床应用研究

目的基于一次性胃部细胞无创采样器采集胃液标本进行幽门螺杆菌耐药基因检测,指导幽门螺杆菌个体化治疗,探讨此技术的临床应用价值。方法选取2021年5月至2022年5月北京大学深圳医院收治的根治失败2次或以上的难治性幽门螺杆菌感染患者50例,使用一次性胃部细胞无创采样器采集胃液,通过荧光定量PCR法检测抗生素耐药基因,根据耐药结果给予患者制订基于铋剂四联根除治疗方案,疗程14d,治疗结束至少4周后复查尿素呼气试验,确定幽门螺杆菌是否被成功根除。结果在50例送检样本中,检测幽门螺杆菌阳性者为43例。43例个体化治疗患者根除成功41例,幽门螺杆菌感染根除率意向性分析为95.35%(95%CI为84.19%~99.43%),遵循方案分析为97.62%(95%CI为87.43%~99.94%),均显著优于标准铋剂四联疗法(P<0.001)。结论基于一次性胃部细胞无创采样器采集胃液标本进行幽门螺杆菌耐药基因检测技术指导的个体化治疗在顽固性幽门螺杆菌感染患者中取得比较理想的临床效果,具有较好的应用价值。

携带幽门螺杆菌hpaA基因减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建

目的：构建携带幽门螺杆菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ） ｈｐａＡ基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌。方法：用分子生物学方 法将ｈｐａＡ基因克隆人原核表达质粒ｐＴｒｃ９９Ａ，并进行核苷酸测序，重组质粒经鉴定后再导入活减毒鼠伤寒沙门菌 ＳＬ３２６１，提取重组疫苗菌质粒，聚合酶链反应（ＰＣＲ）和酶切鉴定，筛选目的克隆。结果：经ＰＣＲ和酶切证实，构建了 携带ｈｐａＡ基因（５６０ ｂｐ）的重组原核表达质粒ｐＴｒｃ９９Ａ－ｈｐａＡ，并将后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌ＳＬ３２６１。结 论：构建并鉴定了携带Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ ｈｐａＡ基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗苗，为探索制备Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ口服组份活疫 苗奠定了基础。

幽门螺杆菌全长hpaA基因克隆和在大肠杆菌中高效表达

为了构建幽门螺杆菌 (H .pylori)全长hpaA基因表达质粒 ,在大肠杆菌中表达重组HpaA(reHpaA)蛋白 ,我们用PCR扩增全长hpaA基因 ,经适当的酶切 连接反应将其连入原核表达质粒pTrc99A ,反应产物转化大肠杆菌JM10 5 ,用Amp(+)培养基筛选 ,提取重组菌质粒 ,PCR和酶切鉴定 ,筛选阳性克隆 ,并用重组菌质粒进行hpaA基因测序。阳性克隆经IPTG诱导培养 ,用SDS PAGE电泳和Westernblot进行reHpaA表达分析和鉴定 ,用薄层扫描分析reHpaA含量。结果显示 ,重组质粒pTrc99A hpaA经PCR和酶切后均产生 783bphpaA基因。重组菌能表达约30kDreHpaA蛋白 ,含量占全菌体蛋白量的 5 1 99% ,Westernblot证实其有免疫反应性。重组H .pyloriHpaA表达质粒的成功构建及在大肠杆菌中高效表达的实现 ,为探索制备H .

幽门螺杆菌Omp22-HpaA融合基因工程菌蛋白的表达

目的:优化幽门螺杆菌Omp22-HpaA基因工程菌pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达条件,并对其表达产物进行纯化和鉴定。方法:在不同诱导时机、不同诱导剂(IPTG)浓度和不同诱导时间条件下诱导pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量。在优化条件下诱导工程菌表达,并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,采用Amyloss树脂预装柱对可溶性Omp22-HpaA蛋白进行分离、纯化,对纯化后的蛋白行Westernblot分析。结果:工程菌培养2h时加入IPTG(终浓度为0.4mmol/L)诱导7h,目的蛋白Omp22-HpaA表达量达到菌体总蛋白的20%以上。经纯化得到了较高纯度(>90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性。结论:建立了从pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1可溶性表达产物中纯化较高纯度Omp22-HpaA融合蛋白的方法。