幽门螺杆菌热休克蛋白基因HspB-C对甘薯遗传转化的研究

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物,作为生物反应器具有优势。幽门螺杆菌被世界卫生组织认定为一类致癌因子,其热休克蛋白(HSP)具有较强的免疫原性,存在着发展为疫苗成分的可能性。本研究构建了幽门螺杆菌热休克蛋白基因HspB-C植物表达载体,以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转入4个甘薯品种诱导愈伤和再分化,通过PCR检测证明目的基因HspB-C已成功转化入甘薯品种南瑞苕中。

幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的构建表达幽门螺杆菌热休克蛋白60(Hsp60)的候选菌株并研究其免疫原性。方法利用PCR技术扩增Hsp60基因,将其定向插入pET-22b(+)载体,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达并通过动物实验研究其免疫原性。结果克隆的Hsp60基因序列与Genbank公布的一致,Hsp60重组蛋白表达量占菌体总蛋白的27.2%,并可被幽门螺杆菌感染者血清所识别,用其免疫小鼠可产生抗该重组蛋白的抗体。结论Hsp60有可能成为一种有效的疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位基因工程菌的发酵

目的 研究幽门螺杆菌热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）基因工程菌的发酵工艺。方法 通过不同培 养基、不同葡萄糖浓度、不同溶氧条件、补料与非补料对幽门螺杆菌热休克蛋白Ａ亚单位基因工程菌的菌体生长与 外源蛋白表达量的影响的比较，确定其较为合适的培养条件。结果 多批实验证明，菌体单产可达４２ｇ／Ｌ，目的蛋 白的表达率为３８．５％。结论 此发酵工艺可以提高ＨｓｐＡ基因工程菌菌体的得率和目的蛋白的表达。

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的获取人幽门螺杆菌 (helicobacter pylori,Hp)热休克蛋白 A基因 (hsp A )进行核苷酸序列分析。方法利用 PCR技术扩增 Hsp A的 DNA,并将其定向插入 Pin Point TMXa- 3载体中进行核苷酸序列分析。结果所克隆的 Hsp A DNA序列与 Gene Bank公布的序列有 15个碱基存在差异 ,同源 95 .8%。结论所克隆的 Hsp A基因可用于重组表达及相关研究。

人幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及初步应用

目的 获取重组表达人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori ,Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位 ,并应用于临床诊断。方法 利用PCR技术扩增HpHspA基因 ,将其构建至PinPointTMXa 3载体中进行诱导表达 ,并对其产物进行SDS PAGE、免疫印迹等检测。同时 ,将纯化的重组蛋白结合ELISA方法对幽门螺杆菌感染患者清除治疗前后血清中的抗HspA抗体进行检测。结果 所克隆的HspADNA由 3 5 4个碱基组成 ,可编码 118个氨基酸残基的多肽 ,SDS PAGE和免疫印迹显示所表达的蛋白分子量约为 14× 10 3 ,并可与相应的抗血清发生特异反应 ;ELISA结果发现 ,消化性溃疡患者在清除治疗后早期只出现明显的抗HspA抗体滴度下降 ,而抗幽门螺杆菌抗体要在治疗后 6月才出现明显下降。结论 重组表达HspA为诊断。

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)热休克蛋白A亚单位的编码基因(hspA)克隆和序列分析,为H.pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEL-HP27和国际标准参考株H.pylori的hspA基因,通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到0.35kb的hspA基因片段,特异PCR可扩增出hspA基因片段,证实H.pylorihspA基因的重组克隆质粒构建成功。经测序,国内分离HpMEL-HP27的hspA基因全长357bp(Genbank收录号:AY295084),编码由118个氨基酸残基组成的肽链,hspA基因序列与GenBank公布的H.pylori相应基因同源性高达95.20％-97.48％,氨基酸序列同源性在95.76％-97.46％之间。结论 克隆了H.pylori菌株MEL-HP27的hspA基因,其核酸序列与国际参考株NCTC11637同源性为97.48％。

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆、表达及抗原性研究

目的:构建含人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体、进行核甘酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础方法:利用分子克隆技术从Hpylori DNA染色体中,扩增热休克蛋白A编码基因片段;将目的基因与载体pET32a(+)同时经kpn Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切、纯化、连接后,转化含有目的基出的重组载体;以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达;表达产物经纯化后,用Western blot法检测其抗原性结果:经酶切、测序分析表明,插入的基出片段为Hpylori热休克蛋白A编码基因,与GenBank报道的相比较,有1.6％的碱基(bp)发生变异,1.6％的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白M_r为33×10~3。其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×10~3,可溶性表达产物占全菌总蛋白的18.96％,重组蛋白经Ni^+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95％以上.用Westernblot方法检测显示,该重组蛋白可被Hpylori阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性。结论:成功地克隆并表达了Hpylori热休克蛋白A码基因,为Hpylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础。

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及表达

目的扩增人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)编码基因并构建其重组表达载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,为疫苗的开发奠定了基础。方法利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A(HspA)基因片段,目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后,插入pET32a(+)载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达。结果经PCR、酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA编码基因,与GenBank报道的相比较,核酸同源性达98%。经SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白分子量约为33 KD,其中目的蛋白的分子量约为13 KD。结论成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因,为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆和表达

目的 扩增幽门杆菌热休克蛋白A 35 1bp的DNA片段 ,并将其克隆到pET - 2 8a(+ )质粒中高效表达。方法 用PCR方法扩增的片段经测序后 ,用GoldKey分析软件进行序列分析 ,应用pET - 2 8a(+ )系统在受体菌BL2 1(DE3)pLysS中表达热休克蛋白。结果 该序列表达的蛋白与已报道的热休克蛋白A序列相似。重组菌株用IPTG诱导后 ,经SDS PAGE和薄层扫描分析 ,表达的外源蛋白的相对分子质量为 180 0 0 ,以包涵体的形式存在 ,表达产物占菌体总蛋白的 6 4%。结论 HspA是最有可能做为H .

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析

目的 :获取含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,为在E .coliBL2 1中表达 ,疫苗的开发奠定基础。方法 :利用分子克隆技术从HpDNA染色体中 ,扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经kpnⅠ、BamHⅠ双酶切、纯化、连接后。转化含有目的基因的重组载体 ,进行序列分析。 结果 :经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因 ,与GenBank的报道相比较 ,有 1.4 %的bp发生变异 ,1.6 %的氨基酸残基改变。其同源性高达 98%。结论 :成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因 ,为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。

幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌热休克蛋白60基因（Hsp60），并将它克隆到质粒 pET－22b（+）中进行核苷酸序列分析。方法 利用 PCR技术扩增 Hsp60，并将其定向插入 pET－22b（＋）载体中，通过 DNA序列分析仪进行核苷酸分析。结果DNA序列分析表明，所克隆的Hsp60基因序列与GeneBank公布的一致。结论 获得了序列正确的Hsp60基因，为其重组表达及相关研究奠定了基础。

携带幽门螺杆菌热休克蛋白B亚单位基因重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建和鉴定

背景:幽门螺杆菌(H.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌,以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建活疫苗已成为探索新型H.pylori疫苗的重要途径。目的:构建携带H.pylori热休克蛋白B亚单位(hspB)基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌。方法:应用基因工程技术将1640 bp的hspB基因克隆入原核表达质粒pTrc99A。对重组质粒进行序列测定,并将测序结果与基因文库中H.pylori-hspB的基因和蛋白序列进行BLAST分析,再将重组质粒导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结果:重组质粒经聚合酶链反应(PCR)和双酶切,证实构建了携带hspB基因的重组原核表达质粒pTrc99A.hspB,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。所构建的重组质粒pTrc99A-hspB中所含的H.pylori-spB与基因文库中H.pylori-hspB基因和蛋白的同源性均为97％。结论:成功构建并鉴定了携带H.pylori-hspB基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌,为研制H.pylori口服疫苗奠定了基础。

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及表达

目的:扩增人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)热休克蛋白A(heat shock protein A,HspA)编码基因并构建其重组表达载体,进行核苷酸序列分析,并在E.coli BL21中表达,为疫苗的开发奠定了基础。方法:利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A(HspA)基因片段,目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后,插入pET32a(+)载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达。结果:经PCR、酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA编码基因,与GenBank报道的相比较,核酸同源性达98%。经SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白分子量约为33 KD,其中目的蛋白的分子量约为13 KD。结论:成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因,为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。

幽门螺杆菌相关胃病脾胃湿热证患者热休克蛋白70和白细胞介素-8的表达

目的通过检测幽门螺杆菌(Hp)相关胃病脾胃湿热证患者白细胞介素-8(IL-8)及热休克蛋白70(HSP70)的表达,探讨Hp相关胃病脾胃湿热证发生的病理机制。方法选择脾胃湿热证和脾气虚证的慢性胃炎、消化性溃疡患者75例,招募健康志愿者10例作为正常对照。采用免疫组织化学标记法、荧光定量PCR法检测各组胃黏膜HSP70、IL-8蛋白及m RNA的表达。结果 HSP70、IL-8蛋白和m RNA表达水平呈现脾胃湿热证患者>脾气虚证患者>正常对照者的趋势。Hp感染者HSP70、IL-8蛋白和m RNA表达水平较非感染者有偏高趋势。结论 HSP70、IL-8的表达与证型及Hp感染可能存在一定的相关性,HSP70表达水平与Hp感染的关系可能部分体现脾胃湿热证的"正邪交争"状态,IL-8的高表达可能为脾胃湿热证Hp作用于胃黏膜的机制之一。

表达幽门螺杆菌热休克蛋白60克隆的构建

目的:构建含Hp热休克蛋白60(Hsp60)基因的重组载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究Hsp60的佐剂功能和免疫原性奠定基础.方法:提取Hp染色体基因,用PCR方法扩增Hsp60基因,将其克隆至表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并通过免疫印迹实验研究其免疫原性.结果:分离得到了1.6kb的Hsp60基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达,在37℃诱导表达3h后,表达产物占细菌总蛋白的27.2%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要是包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的76.6%.经免疫印迹证实该重组蛋白可以被Hp感染患者血清所识别.结论:成功地克隆并表达HpHsp60基因,为Hp疫苗的研制打下了基础.

血清抗幽门螺杆菌热休克蛋白60抗体与消化性溃疡的关系

目的 :探讨幽门螺杆菌 (Hp)感染患者血清抗幽门螺杆菌热休克蛋白60(Hsp60)抗体与消化性溃疡的关系。方法 :检测胃溃疡、十二指肠球部溃疡、慢性浅表性胃炎患者Hp感染及血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体表达情况。结果 :(1)血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体阳性表达仅见于Hp阳性患者。Hp阳性胃溃疡、十二指肠球部溃疡患者血清抗幽门螺杆菌Hsp抗体阳性率明显高于慢性浅表性胃炎患者 (均P<0.05)。(2)26例血清抗幽门螺杆菌Hsp抗体阳性的消化性溃疡患者在Hp根除及洛赛克疗程结束后4周 ,其中7例抗体转为阴性。结论 :血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体可能与Hp感染所致消化性溃疡的发生有关 ;血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体不能作为近期判断Hp根除与否的标准。

BALB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌热休克蛋白A疫苗的免疫应答

目的 评价重组热休克蛋白A (rHspA)作为幽门螺杆菌 (Hp)口服疫苗成分的效果。方法 采用重组Hp保护性抗原HspA与粘膜免疫佐剂 (霍乱毒素 ,CT ;大肠不耐热肠毒素B亚单位 ,LTB)共口服免疫BALB c小鼠 ,ELISA分析小鼠血清、胃肠粘液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况以及IL4、IFN γ的变化。结果 单纯口服rHspA组产生的抗体水平与对照组 (PBS)相差不显著 ,而rHspA +佐剂组与对照组相差非常显著。rHspA +佐剂组小鼠脾淋巴细胞体外培养 ,在Hp抗原刺激作用下出现明显的增殖反应 ;不加佐剂免疫组分泌IFN γ水平增加 ,IL 4水平未发现增加 ;而加佐剂免疫组除IFN γ水平增加外 ,IL 4水平也发现显著增加。结论 BALB

幽门螺杆菌热休克蛋白60脂质体疫苗的制备及其免疫预防作用

目的探讨制备脂质体包裹重组幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白60(Hsp60)口服疫苗的方法,并用Hp感染的小鼠模型评价其在预防Hp感染中的作用。方法将PET-22(+)/Hsp60在BL21(DE3)大肠杆菌表达,Ni-NTA琼脂糖树脂纯化Hsp60重组蛋白,用薄膜分散法制备以卵磷脂和胆固醇为膜组分包裹的Hsp60重组蛋白口服疫苗,并用透射电镜测定其粒径。75只BALB/C小鼠分为5组,分别通过灌胃方法给予PBS、空白脂质体、Hsp60重组蛋白+霍乱霉素(CT)、脂质体包裹Hsp60重组蛋白、脂质体包裹Hsp60重组蛋白+CT,每周1次共4次,末次攻击2周再用活Hp攻击3次,3周后处死小鼠,行胃组织快速尿素酶试验、Hp的定植半定量、炎症程度及其炎症活动度的评分。结果可溶性表达产物占全菌总蛋白的27%,经纯化获得纯度为95%的重组蛋白,制备的脂质体粒径为(0.7±0.4)μm。PBS组和空白脂质体组保护率均为0,而Hsp60重组蛋白+CT组、脂质体包裹Hsp60重组蛋白组、脂质体包裹Hsp60重组蛋白+CT组的保护率分别为73.3%、66.7%和86.7%,且均能使免疫小鼠胃粘膜Hp感染数目明显减少,炎症反应减轻。结论口服脂质体能分地代替免疫佐剂,作为Hp疫苗的免疫佐剂,将具有广泛的应用前景。

灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证小鼠热休克蛋白70和水通道蛋白4的影响

目的观察灭幽汤对幽门螺杆菌(Hp)相关性胃炎脾胃湿热小鼠热休克蛋白70(HSP70)及水通道蛋白4(AQP4)的影响,探讨其作用机制。方法将小鼠随机分为灭幽汤高、低剂量组(灭高组、灭低组)和胃三联组、模型组、对照组,采用复合因素建立BALB/c小鼠Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型,造模成功后连续给药14 d,灭高组、灭低组、胃三联组给药剂量分别为12.4、6.2 g/kg和0.279 8 mg/kg;采用Western Blot检测HSP70、免疫组化法检测AQP4的表达情况。结果与对照组比较,模型组HSP70、AQP4蛋白表达显著增加(P<0.05);与模型组比较,灭高组、灭低组、胃三联组小鼠HSP70蛋白表达显著增加、AQP4蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论灭幽汤可能通过上调HSP70、下调AQP4蛋白表达而发挥治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的作用。