幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)诱导T细胞高表达IL-21促进胃黏膜损伤

目的研究幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)是否能通过诱导T细胞分泌白细胞介素21(IL-21)加剧幽门螺杆菌(H.pylori)感染后的炎症反应及黏膜损伤。方法收集H.pylori感染确诊患者临床内窥镜取得的胃黏膜,以及经根治后再次通过内窥镜取得胃黏膜,通过反转录PCR和Western blot法检测胃黏膜IL-21、基质金属蛋白酶2(MMP2)和MMP9的mRNA水平及蛋白水平;同时克隆构建表达并纯化HpaA,并取健康未感染成年人外周血单个核细胞(PBMC),磁珠分选获得CD3^+T细胞。使用重组HpaA刺激分选获得的细胞,ELISA检测其上清中IL-21的水平;培养胃黏膜AGS细胞系并使用抗IL-21抗体中和培养液中的IL-2124 h,Western blot法检测AGS细胞中MMP2及MMP9的蛋白水平。结果H.pylori感染的胃黏膜中IL-21、MMP2和MMP9蛋白水平显著高于根治后的胃黏膜。重组HpaA蛋白能显著诱导CD3^+T细胞分泌高水平的IL-21,IL-21处理增加AGS细胞MMP2及MMP9的表达水平;使用抗体阻断IL-21后,MMP2及MMP9的蛋白水平显著降低。结论HpaA通过诱导T细胞产生IL-21促进H.pylori感染导致的胃黏膜损伤。

幽门螺杆菌黏附素研究进展

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）是一种定植于胃和十二指肠黏膜的革兰阴性菌．与慢性胃炎、消化道溃疡和胃癌的发生密切相关。耶感染率在世界人群中超过50％。目前针对跏的感染主要是采取三联或四联抗菌疗法。然而。随着耐药菌株的不断增多，研制安全有效的疫苗成为控制耶感染的新出路。

幽门螺杆菌黏附素基因babA_2的克隆、序列测定及其生物信息学分析

目的:获取幽门螺杆菌黏附素基因babA_2,并将他克隆到质粒pET-22b(+)中进行核苷酸序列分析,并对其进行生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供基础方法:利用PCR技术扩增babA_2,并将其定向插入pET-22b(+)载体,通过DNA序列分析仪进行核苷酸分析,生物信息学软件对其进行生物学特性分析。结果:DNA序列分析表明,所克隆的babA_2基因序列与GenBank公布的一致。ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质分子量约为78KD,并显示出了良好的抗原性和疏水性。结论:本研究获得了序列正确的babA_2基因,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性,为其重组表达及其相关研究奠定了良好的基础。

幽门螺杆菌黏附素HLA-DRB1限制性CD4+T细胞表位的预测与鉴定

目的针对中国汉族高频HLA-DRB1基因型人群,预测与鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素蛋白A亚单位(neuraminyllactose-binding hemagglutinin,HpaA)CD4+T细胞表位。方法通过Allele Frequency Net数据库分析中国汉族人群HLA-DRB1高频基因型,利用NetMHCIIpan对HpaA蛋白中能被这些高频基因型递呈的CD4+T细胞表位进行预测;通过PCR-SBT法筛选携带有这些高频基因型的H.pylori感染者,利用重组HpaA抗原刺激感染者外周血单个核细胞体外扩增出HpaA抗原特异性T淋巴细胞后利用合成短肽对所预测表位进行鉴定,通过抗体阻断实验对表位的HLA限制性进行分析,利用DC细胞负载重组HpaA蛋白对表位的自然递呈特征进行分析。结果中国汉族人群中HLA-DRB1高频基因型为DRB1*0901(14.4%)、DRB1*1202(13.3%)和DRB1*1501(10.8%),针对上述3种高频基因型预测出24个HpaA蛋白CD4+T细胞表位。其中,4个表位:HpaA39-53(HLA-DRB1*0901)、HpaA42-56(HLA-DRB1*0901)、HpaA89-103(HLA-DRB1*1202)和HpaA87-101(HLA-DRB1*1501)可有效刺激体外扩增的HpaA特异性T细胞产生高水平IFN-γ,且均能被DC细胞自然递呈。结论鉴定得到的4个HLA-DRB1限制性CD4+T细胞表位有可能成为H.pylori表位疫苗设计的候选抗原。

抗幽门螺杆菌粘附素HpaA卵黄抗体的制备

目的研制高效价特异性的抗幽门螺杆菌黏附素鸡卵黄抗体免疫球蛋白抗体。方法用纯化重组幽门螺杆菌黏附素(Helicobacter pyloriadhesin A,rHpaA)抗原免疫22周龄罗曼鸡,母鸡免疫应答后,在卵黄中产生抗幽门螺杆菌黏附素抗体;经硫酸铵法初步纯化浓缩后;以间接ELISA鉴定抗体效价及免疫学活性;采用Bradford法测定蛋白含量;并用SDS-PAGE法测定分子量及鉴定抗体纯度。结果母鸡初次免疫第10d即有抗体产生,初次免疫后75d左右抗体效价超过1∶10000;最高可达为1∶12800。卵黄抗体经硫酸铵法纯化后,用SDS-PAGE分析,出现两条蛋白带,纯度达95%以上。其含量为10.56mg/ml蛋黄。结论本研究首次研制并鉴定抗黏附素卵黄抗体,开拓了我国预防幽门螺杆菌感染的新领域,分析了抗体在产蛋期卵黄液中表达的进度,为今后该抗体的持续、高质量诱导奠定基础。有望获得高效价、高产量的抗黏附素的IgY抗体(IgY-HpaA),为制备口服制剂开辟了广阔前景。

重组幽门螺杆菌多价疫苗CTB-HUUL免疫治疗效果研究

目的构建口服重组幽门螺杆菌(H.pylori)多价疫苗CTB-HpaA-UreA-UreB-CagL(CTBHUUL),并探究其在BABL/c小鼠体内抗H.pylori SS1感染的免疫治疗效果。方法根据文献资料查找H.pylori相关黏附分子(HpaA、UreA、UreB)抗原的显性表位序列HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561,在其C端引入H.pylori黏附分子抗原CagL,再在其N端引入分子内黏膜佐剂CTB,通过Linker(EFM、GS、KK)将其串联,构建重组质粒pET28a(+)/CTB-HapA-UreA-UreB-CagL[pET28a(+)/CTB-HUUL]。将pET28a(+)/CTB-HUUL转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达后进行蛋白层析纯化,获得疫苗靶抗原CTB-HUUL,并采用Western Blot和ELISA对其进行免疫反应性和免疫原性鉴定。6周龄BABL/c小鼠,108 CFU,1次/d,进行灌胃,连续感染4次;末次灌胃后4周,灌胃CTB-HUUL重组蛋白200μg·次-1·周-1,连续免疫治疗4次。末次免疫治疗后2周,脱颈处死小鼠,取小鼠胃组织进行H.pylori SS1计数和病理切片HE染色。结果获得了高纯度的CTB-HUUL蛋白,Western Blot结果显示,CTB-HUUL可以与鼠抗H.pylori SS1血清及鼠抗CTB抗体发生特异性反应;ELISA检测结果显示,CTB-HUUL体外可以与重组蛋白rHpaA、rUreA、rUreB、rCagL发生特异性反应。CTB-HUUL组小鼠胃组织H.pylori SS1培养计数结果较CTB组和PBS组低(P<0.01),CTB-HUUL组小鼠胃组织炎症损伤程度及炎症细胞浸润程度较CTB组和PBS组轻微。结论口服重组H.pylori多价疫苗CTB-HUUL对感染H.pylori SS1的BABL/c小鼠具有免疫治疗效果。

嵌合鞭毛蛋白和壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶封装对鼻接种幽门螺杆菌黏附素诱导的免疫应答的佐剂作用

【目的】幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)是幽门螺杆菌疫苗的一种有希望的抗原。探索嵌合鞭毛蛋白(cFLN)和壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶包封对鼻递送抗原HpaA诱导的免疫应答增强的佐剂作用。【方法】通过将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的D0、D1结构域与幽门螺杆菌鞭毛FlaA的D2、D3结构域相结合,构建嵌合鞭毛蛋白cFLN。作为分子内佐剂,嵌合鞭毛蛋白cFLN与黏附素(HpaA)连接构建复合抗原cFLN-HpaA。cFLN、HpaA、cFLN-HpaA在重组大肠杆菌中表达,并通过Ni-NTA预装色谱柱进行纯化。使用离子凝胶法分别将cFLN、HpaA、cFLN-HpaA包封到壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶中。【结果】成功表达和纯化了cFLN、HpaA和cFLN-HpaA,并用离子凝胶法将这3种抗原包封在CS/TPP/纳米凝胶中,制备了包封cFLN的CS/TPP纳米凝胶(cFLN-HpaA NG)、包封HpaA的CS/TPP纳米凝胶(HpaA NG)、包封cFLN-HpaA的CS/TPP/纳米凝胶(cFLN-HpaA NG)。经鼻免疫小鼠后,与HpaA相比,cFLN-HpaA分别导致血清中IgG、IgG1和IgA含量增加2.09倍、1.4倍和2.62倍。与cFLN、HpaA和cFLN-HpaA相比,cFLN NG、HpaA NG和cFLN-HpaA NG分别使血清中IgA、IgG、IgG1和IgG2a的含量增加了1.28至1.71倍。【结论】cFLN和CS/TPP NG可以显著增强鼻腔输送的HpaA诱导的体液免疫。通过检测鼻腔免疫后胃黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17和SIgA的含量,与HpaA相比,cFLN-HpaA分别诱导IFN-γ、IL-4和SIgA的含量增加1.38、1.16和1.58倍。与cFLN-HpaA相比,cFLN-HpaA NG分别使小鼠胃黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17和SIgA的含量增加1.81、1.71、2.16和2.1倍。表明cFLN和CS/TPP NG可以显著增强Th1和Th17型免疫应答。小鼠体内免疫原性研究表明,分子内佐剂cFLN和纳米凝胶包封不仅可以有效增强鼻腔输送HpaA诱导的体液免疫应答,而且还可以增强小鼠胃黏膜中的黏膜免疫应答——Th1和Th17型免疫应答。因此,这些结果表明,cFLN-HpaA NG可能是有希望的经鼻输送的用于预防幽门螺杆菌感染的疫苗系统。

抗幽门螺杆菌黏附素蛋黄抗体与HP1188蛋黄抗体在小鼠体内防治幽门螺杆菌感染的比较

目的比较抗幽门螺杆菌黏附素(Helicobacter pylori adhesin A,HpaA)蛋黄抗体(immunoglobulin yolk,IgY)(HpaA-IgY)及抗H.pylori HP1188 IgY(HP1188-IgY)在BALB/c小鼠体内预防和治疗H.pylori感染的最低浓度,并评价治疗效果。方法Western blot鉴定HpaA-IgY及HP1188-IgY抗原特异性。制备1×10^9 CFU/mL H.pylori菌液,将BALB/c小鼠随机分为阳性对照组(灌喂H.pylori菌液0.5 mL)、阴性对照组(以布氏肉汤替换H.pylori)、预防组(先灌喂1、3、5 mg/mL HpaA-IgY或HP1188-IgY及PBS各1 mL,再灌喂H.pylori菌液0.5 mL)、治疗组(先灌喂H.pylori菌液0.5 mL,再灌喂1、3、5 mg/mL HpaA-IgY或HP1188-IgY及PBS各1 mL)。处理完成后,取各组小鼠胃组织进行H.pylori培养、快速尿素酶试验(rapid urease test,RUT)及组织学检查,观察H.pylori定植及炎症反应情况。结果经Western blot分析,HpaA-IgY及HP1188-IgY分别与重组HpaA和HP1188蛋白发生特异性结合。阳性及PBS对照组小鼠感染率均为100%。与PBS对照组比较,5 mg/mL HpaA-IgY及3 mg/mL HP1188-IgY预防组和治疗组感染率均降低,RUT、H.pylori定植及炎症程度评分均显著降低(P均<0.05),均达到较理想的预防和治疗效果。结论HpaA-IgY及HP1188-IgY对感染H.pylori小鼠均有预防和治疗双重作用,剂量选择HP1188-IgY优于HpaA-IgY。本文为制备防治H.pylori感染的口服生物制品提供了参考。

重组Hp疫苗CTB-HUUC对BALB/c小鼠Hp感染的预防效果

目的:构建口服幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)多价表位疫苗CTB-Hap A-Ure A-Ure B-CagA(CTB-HUUC),观察其在BABL/c小鼠体内抗Hp SS1感染的免疫预防效果。方法:文献查找Hp相关黏附分子(HpaA、UreA、UreB)抗原的显性表位序列HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561,在其C端引入Hp黏附分子抗原CagA,再在其N端引入分子内黏膜佐剂霍乱毒素B亚基(cholera toxin B,CTB),通过Linker(EFM、GS、KK)将其串联,构建重组质粒pET28a(+)/ctB-hpa A-ureA-ureB-CagA[pET28a(+)/ctB-HUUC]。将pET28a(+)/ctB-HUUC转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达后进行蛋白层析纯化,获得疫苗靶抗原CTB-HUUC,并采用Western Blot和ELISA对其进行免疫反应性和免疫原性鉴定。6周龄BABL/c小鼠,分别用CTB-HUUC重组蛋白、CTB、PBS 200μg,每周一次灌胃,连续免疫治疗4次。末次免疫治疗后2周,用10~8CFU的幽门螺杆菌悉尼株(Helieobacter pylori Sydney Strain1,Hp SS1),每天一次灌胃,每次50μL,连续感染4次;两周后脱颈处死小鼠,取小鼠的胃窦部组织进行快速尿素酶试验,其余胃组织进行Hp SS1计数和病理切片HE染色。结果:获得了高纯度的CTB-HUUC蛋白,Western Blot结果显示CTB-HUUC可以与鼠抗Hp SS1血清及鼠抗CTB抗体发生特异性反应,人抗神经节苷脂抗体酶联免疫吸附法(GM1-ELISA)检测重组蛋白CTB-HUUC体外可结合GM1,具有良好的佐剂活性。CTB-HUUC组小鼠胃组织快速尿素酶试验阳性明显比CTB组和PBS组少(P<0.01),Hp SS1培养计数结果较CTB组和PBS组显著减少(P<0.01),炎性损伤程度及炎性细胞浸润程度较CTB组和PBS组轻微。结论:口服重组幽门螺杆菌多价疫苗CTB-HUUC对BALB/c小鼠的Hp感染预防有效。