广西巴马小型猪睾丸发育过程中组织形态及生殖激素水平的变化

为探究广西巴马小型猪睾丸的生长发育规律,为初情期和性成熟的判定提供依据,本实验采集广西巴马小型猪胚胎期65、90、105 d和出生后0、30、60、90、120、150、180、300 d的睾丸组织,测定睾丸长径、短径、厚径、重量等形态学指标,通过HE染色观察其组织特征,并使用ELISA方法测定出生后不同日龄的生殖激素水平。结果显示:随着日龄增加,睾丸各形态学指标持续增大,0~30 d各项指标增长速度最快,睾丸指数呈现先升高后降低的趋势,并在出生后60 d达到最大值;睾丸的各形态学指标间均呈正相关(P<0.01)。组织学观察表明,出生后60 d的睾丸和附睾中各部位内开始出现精子,已达到初情期;胚胎期生精小管的直径与面积在不同胎龄间差异不显著,出生后,与30 d相比,60 d睾丸的生精小管直径和面积增加(P<0.05)。促性腺激素释放激素(GnRH)存在2个快速上升的阶段(0~30 d和90~120 d),120 d之后迅速下降,卵泡刺激素(FSH)在出生后呈现阶梯式上升的趋势,30~60 d出现首次快速上升,黄体生成素(LH)在120 d快速增长至150 d后逐渐下降,睾酮(T)在出生后经过短暂下降逐步上升至120 d,120~150 d出现一次快速上升,180 d达到峰值后快速下降。本实验发现,广西巴马小型猪胚胎期65~90 d和出生后0~60 d是其睾丸快速发育的时期;出生后30~60 d是精子发生的关键时期,初情期在30~60 d;巴马小型猪睾丸在60 d时已具备基本的生精能力,在150 d时基本发育成熟。

广西巴马小型猪内脏器官生长发育及血清生化指标研究

本研究旨在分析广西巴马小型猪不同生长阶段内脏器官、肠道组织形态发育以及血清生化指标的变化,为保护广西地方小型猪品种、医学动物模型的开发提供参考。实验猪由广西大学巴马小型猪繁育中心实验牧场培育,在0、30、60、90、120、180日龄时分别选择4头健康且体重相近的母猪进行屠宰,采集血液、心、肝、脾、肺、肾、空肠和回肠,测定不同日龄下广西巴马小型猪内脏器官的重量和血清生化指标,测定30、90、180日龄的空肠、回肠肠绒毛长度、数量和小肠腺平均直径、数量。结果表明:在所测日龄内,广西巴马小型猪内脏器官的生长强度顺序依次为肝脏、肺脏、肾脏、心脏、脾脏,其相对生长速度由快到慢依次为脾脏、肝脏、肺脏、心脏、肾脏。90日龄和180日龄广西巴马小型猪的空肠绒毛长度显著高于30日龄;180日龄的空肠绒毛数量显著高于30日龄;180日龄的空肠肠腺直径显著高于90日龄与30日龄;90日龄空肠肠腺数量达到最高后下降,180日龄的空肠肠腺数量显著低于90日龄。90日龄和180日龄广西巴马小型猪的回肠绒毛长度显著高于30日龄;30日龄的回肠绒毛数量显著高于180日龄;180与90日龄的回肠肠腺直径显著高于30日龄;随着日龄的增加,回肠肠腺数量呈上升趋势,但每个时期差异均不显著。本实验结果说明,广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏与肾脏的生长速度在0~30日龄最大;广西巴马小型猪肝脏发育的基本结构单位肝小叶在30日龄左右时基本形成,其肝脏组织结构发育的稳定期推测可能在210~240日龄,由于样本有限,具体发育稳定期有待后续研究;随着日龄增长,广西巴马小型猪空肠、回肠的肠绒毛和肠腺发育不断完善,但是空肠肠绒毛与肠腺的生长发育比回肠更好,推测空肠是饲料消化吸收的主要场所。

中华眼镜蛇毒致广西巴马小型猪坏死组织渗出液中的蛇毒成分分析

目的:探究中华眼镜蛇毒致广西巴马小型猪坏死组织渗出液中的蛇毒成分及其蛋白表达的动态变化。方法:给予广西巴马小型猪注射中华眼镜蛇毒,构建蛇伤中毒的局部组织坏死模型,在注射毒素后的6 h、12 h、24 h、36 h和48 h取小猪坏死组织的渗出液,采用无标记的蛋白质组学技术鉴定分析渗出液中蛇毒蛋白质组成及动态变化,通过对所鉴定出的蛋白进行KEGG及GO通路富集分析,以深入了解蛇毒蛋白相关的生物学功能。结果:通过蛇伤中毒后广西巴马小型猪的生物学行为、局部肌肉组织的病理结果、注射部位的伤口变化来评判动物模型,广西巴马小型猪中毒后出现呼吸急促、肌肉组织坏死、局部伤口溃烂等症状,均符合临床特征的实际情况,表明成功构建了中华眼镜蛇毒导致局部组织坏死的广西巴马小型猪模型。在广西巴马小型猪的局部组织坏死渗出液中鉴定到40种蛇毒蛋白质,涵盖三指毒素、磷脂酶A2、富含半胱氨酸分泌蛋白、蛇毒金属蛋白酶、核苷酸焦磷酸/磷酸二酯酶等蛇毒蛋白家族,并呈现出动态性数量变化。结论:在中华眼镜蛇毒致广西巴马小型猪过程中,不同时间段的组织渗出液中均鉴定出多种三指毒素、磷脂酶A2等蛇毒蛋白,其可能在局部组织坏死中发挥着重要作用。

巴马小型猪仰卧位的新型固定方法

目的 研究广西巴马小型猪仰卧位的固定方法以便于动物实验的开展。方法 选择行胸腔器官获取的广西巴马小型猪12头,接受全身麻醉后采用专用的固定装置进行仰卧位固定。结果 12头广西巴马小型猪在手术中体位得到很好的保持,未发生侧翻、移位等现象。结论 采用专用的固定装置对广西巴马小型猪进行仰卧位固定是一种简单有效的方法。

广西巴马小型猪21个微卫星座位的DNA多态性分析

利用 2 1个微卫星座位统计了广西巴马小型猪品系内的等位基因组成 ,计算了各位点的基因纯合率和多态性信息含量 (PIC)及平均杂合度。结果 ,2 1个位点的平均基因纯合率为 5 5 .5 % ,平均PIC为 0 .3 5 0 1,平均杂合度为 0 .3 881。结果提示 ,广西巴马小型猪具有一定的遗传稳定性 ,已成为一个稳定的遗传群体 。

贵州小型香猪和广西巴马小型猪微卫星位点的遗传学分析

利用35个微卫星位点对贵州小型香猪、广西巴马小型猪的封闭群进行了遗传检测;计算出两个小型猪品系个体样本微卫星位点的平均杂合度、多态信息含量（PIC）、有效等位基因数及品系间的遗传距离。结果表明两个品系的小型猪平均杂合度和PIC均较低;有效等位基因数与实测等位基因数较接近,也表明两品系均有稳定的遗传;两者的遗传距离表明贵州小型香猪和广西巴马小型猪亲缘关系较近,同时表明两者已分别成为两个独立的封闭群动物。

广西巴马小型猪和贵州小型香猪的DNA指纹分析

目的 应用DNA指纹分析的方法研究广西巴马小型猪和贵州小型猪的遗传背景。方法 采用ECL核酸直接标记和检测系统 ,以HRP标记JL 0 2多位点小卫星探针 ,对广西巴马小型猪和贵州小型猪基因组DNA的HinfⅠ或HaeⅢ酶切DNA片段进行Southern杂交 ,以化学发光法进行检测 ,获得了清晰可辨的、具有高度多态性的DNA指纹图。结果 广西巴马小型猪大于 2kb的HinfⅠ和HaeⅢ酶切DNA指纹图带数为 11 7和 2 4 5 ;贵州小型猪大于 2kb的HinfⅠ和HaeⅢ酶切DNA指纹图带数则为 15 8和 17 6。另外 ,广西巴马小型猪HinfⅠ和HaeⅢ酶切产生的不同个体DNA指纹的相似系数分别为 0 5 4± 0 0 7和 0 5 5± 0 0 8;而贵州小型猪则分别为 0 5 3± 0 0 4和 0 5 3± 0 0 7。结论 该探针适用于这两种猪的DNA指纹分析 ,不同酶切产生的DNA指纹图带数不同 ,但不同个体间相似系数的分析结果一致。同时说明这两种猪具有相当程度的种质均质性 。

广西巴马小型猪克隆胚的构建及胚胎移植

通过胚胎移植验证构建的广西巴马小型猪克隆胚是否可以发育到期。利用刺入式手术胚胎移植法,将0.5～1.5日龄巴马小型猪克隆胚移植到2头巴马小型猪和2头陆川猪的输卵管壶腹部。其中2头巴马小型猪和1头陆川猪返情,另外一头陆川猪于2007年10月13日产下1头克隆雄性巴马小型猪。说明巴马小型猪克隆胚能够在受体猪体内发育到期并产仔。

广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性研究

为探讨广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性,以其耳组织为试验材料,经PCR扩增获得广西巴马小型猪SLA-DQB外显子2片段,片段大小为273 bp,含有1个RsaI酶切位点和5个HaeIII酶切位点,基因型分别为27bp/246 bp和84 bp/83 bp/7 bp/16 bp/29 bp/54 bp。采用PCR-RFLP对30头广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的PCR扩增产物进行多态性分析,发现广西巴马小型猪封闭群内S,LA-DQB基因外显子2无多态性位点;而克隆测序及同源性比较分析表明,广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2序列与普通猪(Sus Scrofa)、人类(Homo sapiens)的同源性分别为94.1%、79.1%。

广西巴马小型猪肥胖基因(leptin)成熟肽序列的cDNA克隆、序列分析

以广西巴马小型猪的脂肪组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增出巴马小型猪的leptin基因成熟肽序列,经纯化回收后连接到pMD18-T载体上,经鉴定后测序。研究结果表明,本试验克隆到leptin基因成熟肽cDNA序列,其长度为441 bp,与GenBank中报道的猪leptin成熟肽cDNA序列同源性高达99.06%,与奶牛、家鼠、马等物种的成熟肽cDNA序列间同源性可达到84.5%以上,证明leptin基因具有较高的保守性。同时发现,与普通猪相比,巴马小型猪leptin基因成熟肽cDNA序列有四处存在碱基突变,均为无义突变。

广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型的制作

本试验旨在制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型,初步判断猪发生动脉粥样硬化时的指数值,以期为今后建立相关模型提供依据。试验选取广西巴马小型猪试验组和对照组各10头,通过饲喂高脂高胆固醇饲料建立动脉粥样硬化模型,检测建模过程中血液生化指标,将动脉粥样硬化指数与血管切片作关联分析,初步拟定发生动脉粥样硬化时的指数值。屠宰后血管切片结果显示,试验组有2头广西巴马小型猪发生动脉粥样硬化,对照组均正常。2头广西巴马小型猪的血管切片结果与动脉粥样硬化指数进行关联分析后,初步拟定的动脉粥样硬化指数值在3.8以上,并持续3个月以上。

广西巴马小型猪近交群体的遗传结构分析

本研究以33头广西巴马小型猪为研究对象，利用19个微卫星标记，通过估算其等位基因数（N）、多态信息含量（PIC）和近交系数（F）等参数，对广西巴马小型猪近交群F10～F15世代进行了遗传学检测。试验结果显示，19个微卫星座位上共检测到31个等位基因，其中F10F15分别具有27、29、28、27、26和25个等位基因，平均每个位点分别仅有1．42、1．53、1．47、1．42、1．37和1．32个等位基因；6个世代群体平均多态信息含量为0．1044。广西巴马小型猪F10～F15世代的平均近交系数分别为0．8070、0．8263、0．8491、0．8710、0．8904、0．9118。结果表明，广西巴马小型猪近交群体的基因多态性低、近交程度高，是一个遗传性稳定的群体。

广西巴马小型猪Tau基因可变剪接体的克隆和鉴定

为研究广西巴马小型猪‰基因可变剪接体序列，根据NCBI中预测的猪‰基因序列设计引物，利用巢式PCR和5’RACE方法克隆并验证‰基因。结果显示：广西巴马小型猪Tan基因与参考序列相比存在3处缺失，分别为191～277、344～1389、1526～1579bp。3处缺失形成4条Tau基因的可变剪接体，其序列长度分别为1302、1215、1356、1269bp，提交至GenBank获得登录号分别为KC473498、KC473499、KC473500、KC473501。

广西巴马小型猪2型糖尿病模型骨骼肌糖代谢及能量代谢相关基因的表达差异

目的探讨糖代谢及能量代谢过程中的关键调控基因(PGC-1α、Glut-4、ERRα、NRF-1、TFAM和线粒体基因)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)发生中的作用。方法以广西巴马小型猪T2DM模型建立的发病组和未发病组的背最长肌为实验材料,利用QRT-PCR实时荧光定量的方法对糖代谢及能量代谢相关基因mRNA和线粒体基因的表达情况进行检测。结果在广西巴马小型猪背最长肌中,T2DM组PGC-1α、Glut-4、ERRα和NRF-1的相对表达量均显著高于非T2DM组,TFAM和线粒体基因的相对表达量则稍低于非T2DM组。结论在T2DM巴马小型猪骨骼肌中,上调PGC-1α及其下游基因Glut-4、ERRα和NRF-1的表达水平,有利于改善葡萄糖代谢;而线粒体合成不足,致使ATP合成量不够,或引起胰岛素抵抗,进而导致2型糖尿病的发生。

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因(ApoE)真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列(NM_214308)对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。

广西巴马小型猪IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析

为研究猪白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素10(IL-10)在机体免疫应答中的作用,从ConA刺激的巴马小型猪的外周血淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出IL-4和IL-10基因,将其分别克隆到PMD18-T 载体上,进行序列分析.结果表明,克隆的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列与GenBank上登录的其它猪种的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%～100%、97.0%～99.3%和99.2%、97.7%.

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

【目的】克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础。【方法】利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以p EGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。【结果】克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与Gen Bank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸。广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%。构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白。【结论】广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究。

广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建

【目的】克隆广西巴马小型猪α干扰素基因(poIFN-α)全部编码序列并构建其哺乳动物真核表达载体,为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据。【方法】应用RT-PCR扩增广西巴马小型猪poIFN-α编码序列,链接至pMD18-T载体构建重组质粒,以测序正确的重组质粒为模板,PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α基因,然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,并转化感受态细胞DH5α,经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序,用DNASTAR软件及Primer Premer 5.0等对获得的基因序列进行分析。【结果】以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获得的目的片段为618 bp,包含poIFN-α基因全部编码序列;将克隆获得的poIFN-α基因插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中,可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTARGET-poIFN-α。广西巴马小型猪poIFN-α与GenBank上已发表的猪、鼠、人IFN-α基因同源性分别为97.0%、78.2%和66.3%;其成熟肽与普通猪相比,共有17个位点发生碱基突变,其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变。【结论】IFN-α成熟肽在哺乳动物中保守性较差;克隆获得的广西巴马小型猪poIFN-α基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础。

广西巴马小型猪MCP-1基因克隆及序列分析

【目的】研究广西巴马小型猪单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因CDs区的序列特点,为建立广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型及揭示动脉粥样硬化的发生、发展机理提供理论依据。【方法】从广西巴马小型猪动脉血管组织中扩增MCP-1基因CDs区全长序列,与人类及其他易建立动脉粥样硬化模型动物的序列进行比对分析,并预测其蛋白质信号肽位点及结构域。【结果】广西巴马小型猪MCP-1基因CDs区全长300 bp,编码99个氨基酸;与人类MCP-1基因CDs区(S71513.1)的同源性最高,为84.4%。广西巴马小型猪MCP-1蛋白的前23位氨基酸为信号肽,后76位氨基酸为成熟肽,等电点(pI)9.51,蛋白质分子量10976.04kDa,信号肽位置有一段跨膜结构;广西巴马小型猪与人类MCP-1蛋白在形成二级结构时,保守半胱氨酸参与形成二硫键的位置一致,分别在第11、12、36和52号(除信号肽片段)位上排列为Cys-Cys,且是第11号位与第36号位形成二硫键,第12号位与第52号位形成二硫键。【结论】以广西巴马小型猪构建动脉粥样硬化模型时,MCP-1基因表达量可作为判断动脉血管疾病的一个辅助指标。

广西巴马小型猪浅低温心脏不停跳体外循环模型的麻醉管理

目的探讨建立广西巴马小型猪浅低温心脏不停跳体外循环模型的麻醉管理方法。方法广西巴马小型猪13只,10只用于实验,3只用于取血预充。基础麻醉采用阿托品、氯胺酮和咪唑安定肌肉注射,丁卡因喷喉表面麻醉后气管插管,麻醉维持采用丙泊酚、芬太尼、维库溴胺持续静注和间断吸入异氟醚。采用分级评估方法对基础麻醉、全麻维持的效果进行评估。鼻咽温32℃～34℃体外循环,维持心率50～80次/min,窦性节律空跳。结果成功建立浅低温心脏不停跳体外循环模型9只,失败1只(在气管插管时误插入食道缺氧死亡)。基础麻醉Ⅰ级7只(70.0%),Ⅱ级1只(10.0%),Ⅲ级1只(10.0%)。全麻维持Ⅰ级8只(80.0%),Ⅱ级1只(10.0%)。结论选择合适的麻醉方法和效果评估方法,是广西巴马小型猪浅低温心脏不停跳体外循环模型建立的关键。