核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)概述

随着分子牛物学技术的快速发展,体外核酸扩增技术己逐步应用于科研和临床.最近几年才兴起的核酸序列依赖性扩增法(Nuleic and sequerce based amplipicain,NASBA)同传统的实验方法相比有灵敏性高,特异性强,快速,高通量等优点,而倍受中外学者的青睐.本文就NASBA方法作一综述.……

兽医领域病毒宏基因组非序列依赖性单引物扩增方法的研究现状

新一代测序技术的出现和不断完善,极大地推动了宏基因组学的发展。宏基因组学研究的路线主要包括核酸样本制备、高通量测序及生物信息学分析,而核酸样本的质量直接影响后续环节。目前有多种方法可以用于低浓度样本的扩增,其中非序列依赖性单引物扩增(SISPA)法因其经济高效性,越来越受到研究者的青睐。文章就兽医领域病毒宏基因组学研究过程中广泛使用的相关SISPA方法进行概述,包括核酸样本的预处理及扩增方案等,为相关研究提供参考。

核酸序列依赖性扩增、Real-time PCR及GM试验诊断侵袭性曲霉菌感染的临床应用评价

目的核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）、Real-time PCR及GM试验在侵袭性曲霉菌感染中的诊断价值。方法收集2013年11月~2014年6月临床上曲霉菌感染高危病患的血液标本80例,并根据EORTC/MSG诊断标准分为确诊组8例,拟诊组26例,非感染组46例,分别利用NASBA、real-time PCR及GM试验进行检测,计算3种方法的诊断指标并分析评价。结果 NASBA、real-time PCR及GM试验3种方法的灵敏度分别为76.47%、67.65%、52.94%,特异度分别为80.43%、89.13%、80.43%。联合诊断结果显示,NASBA与real-time PCR串联方案有最好的特异度（100%）及阳性预测值（100%）;NASBA与real-time PCR并联方案则最为灵敏（94.12%）。结论 NASBA用于诊断IA最为敏感,而real-time PCR则最为特异,GM试验的表现差于前两者。联合应用的诊断策略,在特定情况下提高临床早期诊断IA的准确性。

基于核酸序列依赖性扩增反应比色法检测沙门氏菌

本文以食源性致病菌中危害居于前列的沙门氏菌侵袭蛋白A基因作为检测靶标,通过改进传统的核酸序列依赖性扩增反应,开发了针对长链DNA的纳米金比色检测方法。本方法利用限制性内切酶和连接酶将T7启动子和终止子序列连接至靶标序列上,形成小型环状双链DNA,在T7 RNA聚合酶的作用下,转录出大量单链RNA序列进行NASBA反应,反应终产物能够促发纳米金探针发生交联聚集,溶液颜色从红色变成蓝色,从而实现对沙门氏菌的定量分析。

基于核酸序列依赖性扩增技术的玉米转基因成分Bar的鉴定

为了开发高灵敏度、高特异性且易于普及的玉米转抗草丁膦抗性Bialaphos resistance(Bar)基因的鉴定方法,采用核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification,NASBA)技术,根据转基因成分Bar基因的mRNA序列,设计合成Bar基因的检测特异引物和探针,通过优化NASBA扩增反应程序和产物检测体系,开发不依赖核酸扩增仪的转基因成分Bar的分子检测试剂盒,短时间内对转基因成分Bar进行高灵敏度筛查。结果表明,检测特异性好且灵敏度高,其灵敏度可达6 fg,样本检测也说明试剂盒具有较高灵敏度和特异性,且适合基层部门和采样现场对Bar转基因成分的早期鉴定。

一种基于核酸序列依赖性扩增技术的高危型人乳头状瘤病毒E6/E7 mRNA检测方法的建立及应用

目的建立一种高效的基于核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)的检测方法,为人乳头状瘤病毒(HPV)的普查和宫颈癌防治提供快速准确的分子检测方法。方法收集用于宫颈筛查或宫颈细胞学异常的液基细胞学样本406个,采用NASBA技术检测这些样本中的高危型HPV E6/E7 mRNA。通过probit回归分析法预测了14种高危型HPV E6/E7 mRNA的95%检测极限。以5种低危型HPV RNA和8种常见病原体RNA为模板对该NASBA检测方法的特异性进行了评估。结果 406个检测样本中各项检测数据齐全者356个。比较病理诊断、HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA3种方法的检测结果,发现随着病理学级别的升高,高危型HPV DNA感染阳性率呈现明显的上升趋势,且高危型HPV E6/E7 mRNA感染阳性率同样呈现明显的上升趋势。probit回归分析结果显示,HPV16、18、33、35、39、45、56、59、66和68预测的95%检出限都低于100拷贝/反应,HPV31、51、52和58预测的95%检出限介于100~300拷贝/反应之间。5种低危亚型HPV RNA和8种病原体RNA的NASBA检测结果均为阴性,表明该检测方法未检出非特异性扩增。结论该研究建立的检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法,具备很好的敏感性、准确性和特异性,同时它的快速、高通量等特点进一步提高了其在预测宫颈癌患病风险中的临床诊断价值。

基于序列非依赖性扩增技术发现未知病毒的研究进展

随着第二代测序技术的发展,组学技术在微生物学领域的运用变得广泛,其中病毒宏基因组学技术在发现未知病毒和病毒检测方面发挥了越来越重要的作用。序列非依赖性扩增是病毒宏基因组学研究中最关键的一步,它直接影响目的序列的获得及后续实验的展开。本文主要介绍和归纳了几种常用的序列非依赖性扩增技术在病毒宏基因组学中的应用,比较、分析了几种序列非赖依性扩增的差别和优缺点,为读者使用此技术提供参考。

基于非序列依赖性单引物扩增和纳米孔测序鉴别乙型流感病毒

目的采用基于非序列依赖性单引物扩增(SISPA)技术的纳米孔测序确定一起不明原因聚集性发热疫情的病原体。方法对疫情中10名患者咽拭子样本抽提核酸后,采用SISPA合成cDNA并建立纳米孔测序文库,在测序仪MinION上测序,对测序数据进行分类学分析和进化分析,最后用实时荧光定量PCR验证。并比较SISPA和随机引物反转录法的核酸富集效果。结果SISPA结合纳米孔测序技术,在8名患者样本中鉴别出乙型流感病毒核酸,检出率为80%。不同样本的乙型流感病毒序列数介于1~1618,单个基因1×覆盖度最高为99.77%。经实时荧光定量PCR验证,所有样本中均检出乙型流感病毒核酸,且Ct值与乙型流感病毒序列数呈负相关。将获得的一致性序列进行比对和进化分析,该序列与美国2022年2月报道的乙型流感病毒PB2基因序列一致性最高,达99.87%,并与美国近4年报道的乙流病毒亲缘关系较近,与我国河南、山东、江西、香港地区、台湾地区等地报道的乙流病毒同源性较低。SISPA富集扩增效果好于随机反转录法。结论SISPA结合纳米孔测序技术可用于聚集性疫情的病原学调查,在不明原因疫情处置中发挥关键作用,为疫情溯源提供参考。

建立核酸序列依赖性扩增方法检测寨卡病毒

目的建立检测寨卡病毒的核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,满足口岸需要。方法根据寨卡病毒NS3基因设计并验证特异性扩增引物,建立NASBA方法。用登革病毒、基孔肯雅病毒、乙脑病毒、黄热病毒作为对照验证方法的特异性;用不同浓度寨卡病毒RNA进行NASBA扩增,确定方法的灵敏度。结果以寨卡病毒RNA为模板扩增获得NS3基因片段,序列分析未发现非特异性扩增。建立的NASBA方法只有寨卡病毒出现目的扩增条带,与对照病毒无交叉反应,最低检测限为1.2 pg/μl。结论建立的NASBA方法可以特异、准确地检测寨卡病毒RNA,可用于口岸寨卡病毒监测。

新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定

2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理（DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA）对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示：病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属（Flavi-virus）坦布苏病毒（Tembusu virus）基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010（简称JS804）。研究结果表明：此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒NASBA-ELISA检测方法的建立

针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF1中编码Nsp2的基因序列设计引物,建立了核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,并结合微孔板中液相杂交和酶标显色反应检测NASBA扩增产物,建立了检测高致病性PRRSV的NASBA-ELISA。琼脂糖凝胶电泳显示,NASBA方法扩增出了特异性的目的条带。将NASBA产物RNA系列稀释后同时进行了ELISA和Northern杂交。结果显示,ELISA和Nor-thern杂交最高可分别检测到1∶50和1∶30稀释的产物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可检测到101.83TCID50/mL的HuN4株PRRSV。该方法只对3株高致病性PRRSV的检测结果为阳性,对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性。结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV。

基于NASBA技术的鹿结核分枝杆菌鉴定方法研究

为了开发高灵敏度、高特异性且易于普及的鹿结核分枝杆菌的鉴定方法,试验采用核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术对引起鹿结核病的常见两种病原体的灵敏度和特异性进行检测,开发出不依赖核酸扩增仪的结核病病原体TB-NASBA分子诊断试剂盒,并用该试剂检测临床样本,同时测定了试剂盒的稳定性、保存期。结果表明：TB-NASBA试剂盒检测灵敏度高且特异性好,其灵敏度可达到1 cfu/m L;临床样本检测也证实TB-NASBA试剂盒具有较高的灵敏度和特异性;TB-NASBA试剂盒在4℃条件下可存放1年,室温只能存放半年。说明TB-NASBA试剂盒不但可用于结核病的早期检测,且不依赖大型设备和专业人员的特点,容易普及,适合基层部门对结核病的早期诊断。

Petri网的状态转换图

给出Petri网的状态转换图模型,并作为分析工具,分析Petri网重复引发序列在状态转换图中的表现特点,给出标注路径(回路)与引发序列(重复引发序列)的关系及其判定条件,并给出求基本重复引发序列的计算方法;定义了可重复序列之间的依赖性和依赖度,准确地给出了可重复序列之间依赖关系的形式描述;分析了Petri网语言的结构特点,证明了任意一个Petri网语言都是一个正规语言表达式与该网的可重复引发序列α闭包的同步.

Petri网语言表达式及其求解算法

Petri网语言是描述网系统动作序列的集合。为了给出一个网系统语言的形式描述,基于Petri网的状态转换图,分析了Petri网的行为特征,定义了α闭包表达式和Petri网语言表达式,给出了求解Petri网语言表达式的算法,为Petri网语言的形式化描述和分析提供了一种新方法。

猪瘟病毒NASBA-RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究基于核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)和反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种针对猪瘟病毒的,快速、灵敏、特异的两步法检测技术。该方法的检测灵敏度与反转录巢式PCR(RT-NestPCR)相当,最低能检测出46 pg/μL的病毒RNA。该方法的建立为猪瘟病毒的快速诊断提供了新思路。

基于DNA“Y”型结构的指数型核酸恒温扩增策略检测microRNA

该文基于“Y”型DNA模板和恒温指数扩增反应(EXPAR)技术的信号放大功能,建立了一种快速低序列依赖性的miRNA检测方法(Y-EXPAR)。以let-7b为检测目标,设计两条部分互补的DNA模板,与目标miRNA共同构成“Y”型结构,能够同时进行双向扩增,反应效率高,反应时间短,并降低了放大性能对模板序列的依赖。方法检出限低至0.3 amol/L(相当于10μL溶液中有1.8拷贝的let-7b),并能区分单碱基差异的let-7家族同源序列。应用于肿瘤细胞裂解液let-7b的检测,POI值与细胞数目对数值呈线性关系,说明Y-EXPAR在实际样品miRNA的检测中具有优势。得益于扩增的高特异性、抗干扰性和低序列依赖性,该方法为miRNA的快速检测提供了新思路,在miRNA相关的疾病研究和临床诊断方面具有良好应用前景。

转录起始位点核小体定位的研究进展

核小体定位是参与真核生物基因表达调控的一种重要的表观遗传因素,深刻影响基因转录、DNA复制与修复等生物学过程。对于在许多基因位点,比如转录起始位点(TSS)、转录因子结合位点(TFBS)等处的核小体定位已有不少报道。主要介绍了核小体的定位特性,综述了转录起始位点处核小体的定位特征,分别从序列依赖性因素和DNA甲基化、组蛋白变体及修饰、染色质重塑、可变剪接等表观遗传因素较为详细地概括了转录起始位点核小体定位的研究进展。

侵染白术的蚕豆萎蔫病毒2号的分子检测与序列分析

为鉴定引起山西绛县白术花叶、黄化等症状的病原，利用生物学接种、非序列依赖性PCR扩增（SIA）和RT-PCR的研究方法，对白术病样进行了研究，结果表明：接种感病白术病汁液的指示植物昆诺藜表现退绿枯斑，经单斑分离后转接健康白术植株呈现出与病样类似的症状，初步证明白术病害可能为病毒引起的；SIA检测表明感病白术为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）侵染所致；为明确BBWV2白术分离物（BBWV2-Am）的分类地位，进一步克隆了BBWV2-Am RNA2外壳蛋白大亚基基因（LCP）和外壳蛋白小亚基基因（SCP）序列；序列同源性分析表明，LCP基因和SCP基因与已发表的BBWV2其它株系相应基因核苷酸序列的同源性分别为79.3%～87.2%和80.1%～89.2%，氨基酸序列同源性分别为91.2%～95.7%和89.4%～95.5%；系统进化树分析显示，BBWV2-Am与BBWV2地黄分离物（BBWV2-Rg）形成一个独立分支，二者亲缘关系最近。这是BBWV2侵染白术的首次报道。

番茄斑萎病毒NASBA检测方法的建立

为建立一种快速检测番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的方法,以TSWV-CP1/TSWV-CP2为引物对TSWV的N基因进行PCR扩增及序列测定,在TSWV N基因的高度保守区设计特异性扩增引物NA-P1/NA-P2进行核酸序列依赖性扩增(NASBA)反应,并对NASBA方法的特异性和灵敏度进行验证。结果表明,建立的NASBA方法最佳反应时间为1.5 h。该方法特异性较好,只有TSWV阳性样品中出现了预期大小为235 bp的扩增产物,与烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus,TBRV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow curl virus,ToYCLV)无交叉反应。灵敏度验证中,实时荧光RT-PCR的灵敏度最高,为1.56×10^(-5)ng/μL感病植物RNA模板,NASBA次之,为1.56×10^(-4)ng/μL,普通RT-PCR最低,为1.56×10^(-3)ng/μL。在对9份实际样品检测中,NASBA的阳性检出率与实时荧光RT-PCR、普通RT-PCR相同,均为33%,高于ELISA检测的22%。表明NASBA方法适用于实际样品检测,可对TSWV进行快速检测。

黄瓜花叶病毒NASBA检测技术的建立

以香蕉花叶病病样为材料,初步建立了黄瓜花叶病毒核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence based amplifica-tion,NASBA)的检测技术。通过以香蕉叶片总RNA为模板,在黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)亚组ⅠRNA 2高保守区设计特异引物,进行NASBA反应,经5%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品中出现了预期大小为310 bp的条带,而阴性和空白对照中均未出现。并对11份香蕉样品分别进行NASBA反应,并经过斑点杂交验证与RT-PCR检测比较,两者的检测结果一致,灵敏度相当,检出限量可达100 pg。