应用16S rDNA扩增子序列分析去卵巢骨丢失小鼠口腔菌群的变化

背景口腔微生物失调加重了多种口腔疾病和系统性疾病的进程。进入绝经后期的妇女罹患口腔黏膜病和加速牙周骨质丢失的风险更高,但口腔菌群变化与女性进入绝经后期之间的联系尚不清楚。目的应用16S rDNA扩增子测序,初步观察卵巢切除小鼠的口腔菌群结构变化。方法16只雌性C57BL/6J小鼠随机分为卵巢切除(ovariectomy,OVX)组和假手术(sham-operated,Sham)组。卵巢切除术4周后对股骨进行显微CT扫描和骨密度与骨参数的分析,取小鼠口腔拭子进行16S rDNA高通量测序。结果与Sham组比较,OVX组骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量显著下降,骨表面积/骨体积和骨小梁分离度显著升高(P<0.05)。两组的口腔菌群共同含有687种ASVs,Sham组特有1086种,OVX特有930种。OVX组的Chao1指数与Sham组差异无统计学意义,但Simpson指数显著低于Sham组(P<0.05)。门水平上OVX组的拟杆菌门和梭杆菌门丰度较Sham组下降(P<0.05)。属水平上OVX组的梭杆菌属、乳酸乳球菌属、萨特氏菌属等菌属的丰度相比SHAM组降低(P<0.05);放线菌属等菌属的丰度相比Sham组升高(P<0.05)。LEfSe分析结果显示,Sham组厚壁菌门和芽孢杆菌纲(Bacilli)的相对丰度升高(P<0.05)。结论卵巢切除小鼠出现骨丢失现象,并且口腔菌群的多样性和菌群结构发生了改变,初步为研究绝经后妇女口腔菌群改变与口腔疾病加重的关系提供依据。

浙江新分离汉坦病毒ZT71株S基因片段的克隆及序列分析

目的为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料,研究汉坦病毒的进化状况及变异程度,为疫苗病毒株的选择使用提供科学依据。方法本实验室利用RT-PCR方法扩增ZT71株S基因片段并克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。结果ZT71株S基因由1754个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。与HTN型病毒(76-118)的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.0%和82.6%,与SEO型病毒(SR-11、R22、Guo3、8610)核苷酸和氨基酸同源性分别为88.4%—96.5%和98.1%—99.0%,与其它型汉坦病毒的同源都很低。结论表明此分离的病毒为SEO型汉坦病毒,为进一步研究其进化和变异提供了有利条件。

鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析

从安徽合肥一养殖户送检的临床样品中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为HF200702。分离株在鸡胚盲传3代过程中可引起典型的侏儒胚现象;基于分离株S1基因序列对毒株进行分型结果显示,分离株属于目前流行的QX型,与H120、M41、4/91、QX等疫苗株的同源性分别为76.1%、75.6%、78.3%、95.0%;用分离株第10代鸡胚尿囊液感染1日龄SPF雏鸡,对雏鸡的致死率为41.6%,感染鸡出现精神沉郁、张口呼吸、气管啰音等临床症状以及气管纤毛摆动停滞、肾脏肿大、尿酸盐沉积等病理变化。感染鸡从感染后第2 d开始持续向外界排毒直至感染后28 d。该研究数据表明,从安徽合肥某养鸡场疑似发生传染性支气管炎的鸡群中分离到QX型的IBV,该毒株对雏鸡有较强的致病作用,研究结果为了解该地区IBV的流行情况提供了参考数据。

鸡传染性支气管炎病毒分离株与疫苗株抗原相关性和S1基因序列分析

本实验挑选8株近年来山东省IBV分离株与疫苗株H120和491,利用SPF鸡分别制备了高免阳性血清,进行鸡胚交叉中和试验,计算其抗原相关系数,鉴定其血清型,并结合S1基因序列分析,研究其血清型和基因型之间的关系。结果显示:SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701与疫苗株H120同属Mass血清型的不同亚型,其它5个分离株与H120和491不属于同一个血清型。结合S1基因序列分析发现,S1基因序列分析与血清中和结果二者不具有明显的相关性,8个分离株分属三个基因群,其中SDTA06111与H120等同属一个基因群,但血清中和实验显示它们不属于一个血清型;CK/CH/SD09/005与一个参考株独自构成一个基因群,其S1基因变异程度较大,并且能够与两个疫苗株发生交叉中和实验,但不属于一个血清型,它可能是一个基因重组后病毒。

鸡肾型IBV分离鉴定及S1基因序列分析

2008年从河南省某肉用鸡场疑似感染肾型IB的病鸡中分离到1株IBV,对该分离毒株进行鸡胚矮小化试验、动物回归试验和血清学鉴定,试验结果表明分离株HeNan10/08为肾型IBV。采用RT-PCR技术扩增分离株的S1基因,并进行克隆和序列分析。结果表明,分离株HeNan10/08与B J株S1基因的同源性最高,核苷酸序列同源性为99.9%,推导氨基酸序列同源性为100.0%;与M41的同源性最低,核苷酸序列为78.7%,推导氨基酸序列同源性为79.0%。

16S rDNA序列分析法在注射剂微生物污染鉴定及溯源分析中的应用

目的对一次注射剂无菌检查阳性结果进行溯源。方法采用16S rDNA序列分析法对污染菌A1和污染调查中采集的16株葡萄球菌进行鉴定和同源性分析,并将分析结果用脉冲场凝胶电泳进行验证。结果A1的鉴定结果为科氏葡萄球菌;科氏葡萄球菌科氏亚种菌株的核糖体16S亚基序列完全相同;结合PFGE分析显示A1来自无菌检查使用的隔离器污染。结论制药企业可以使用16S rDNA序列分析法进行生产和检验中污染菌的鉴定和溯源,但对于与如科氏葡萄球菌科氏亚种一样核糖体16S亚基序列完全相同的菌株,需要结合其他同源性分析方法进行最终的判定。

感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析

目的了解病料中犬瘟热病毒(CDV)的变异情况,为犬瘟热的预防与治疗提供理论依据。方法采用RT-PCR方法对犬病料中CDV的血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)和核衣壳蛋白(N)基因进行扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T-easy载体中测序,并进行序列分析。结果测定一株CDV的H、F和N基因大小分别为1863 bp、1653 bp和2235 bp。同源性分析表明,未发现碱基的插入和缺失。该病毒的H、F和N基因分别与国内强毒株BJ080127株的H基因、GN株的F基因和HL株的N基因亲缘关系最近,氨基酸同源性分别为97.3%、97.7%和99.3%。与国外标准野毒株A75-17在核苷酸水平上同源性依次为94.4%、93.8%和97.2%,与疫苗株CDV3在核苷酸水平上同源性分别为88.5%、88.8%和93.9%。系统进化树表明该病毒与国内强毒株在同一谱系。糖基化分析显示,该病毒在F基因3～5位氨基酸处多出1个糖基化位点。结论本研究从犬病料中成功克隆了犬瘟热病毒血凝素蛋白、融合蛋白和核衣壳蛋白,在F基因中新增了一个糖基化位点,为犬瘟热的遗传变异和流行学研究提供了分子生物学依据。

16S rRNA基因序列用于临床非典型细菌的补充鉴定

目的利用16SrRNA基因序列分析方法鉴定临床非典型细菌,为临床细菌分类鉴定新方法提供补充。方法提取细菌的DNA,自行设计引物并利用PCR技术扩增细菌16SrRNA基因片段,并对扩增片段进行序列测定,利用Blast等在线软件进行序列同源性分析。结果在32株临床非典型细菌中,3株细菌可以鉴定到“属”,29株细菌可以鉴定到“种”,其中2株可以鉴定到“亚种”。结论16SrRNA基因序列分析法是有效的病原细菌分类鉴定的补充。

LME镍、铜期货价格变动的时间序列分析

本文基于2003～2008年伦敦金属交易所(LME)3月镍、铜期货价格的日线数据,运用经典的时间序列R/S分析方法来研究镍、铜期货市场价格的非线性特征。分析结果显示:LME镍、铜期货市场价格波动是典型的有偏随机游动,H值均大于0.5,期货价格时间序列具有持久性趋势;LME镍、铜期货存在大约分别为447天和442天的非周期循环长度。

马腺疫链球菌新疆株2种新SeM基因型的鉴定及其遗传变异分析

为了解马腺疫链球菌新疆流行株的基因型、菌株的遗传多样性和系统发育特征,采集新疆地区某马场患病马匹下颌组织病样,分离马腺疫链球菌(Z422、JMC111),并对分离菌株进行生化特性和耐药特性检测,然后进行16S rRNA基因序列比较和SeM基因分子分型。结果显示,2株分离菌均为马链球菌马亚种,对头孢噻呋、头孢西丁、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺异恶唑敏感,对青霉素、头孢呋辛、氨苄西林、克拉霉素耐药。基于16S rRNA基因序列的分析显示2株菌均归属于Ⅰ群,基因分型鉴定为新的SeM基因型:seM 208和seM 209。

基于16S rRNA序列分析的动物饮片典型菌污染特征研究

目的:探讨以动物组织为药用部位的饮片微生物污染模式及典型菌污染特点。方法:收集16味46批常见动物类饮片,依据2020年版《中华人民共和国药典》规定方法,对样品进行需氧菌总数(TAMC)、酵母霉菌总数(TYMC)、耐热菌及规定控制菌检验;采用多因素线性回归分析方法探究与样品微生物污染载量相关的因素;运用16S rRNA序列分析方法鉴定饮片污染典型菌。结果:37.0%的样品TAMC超过10^(4)CFU·g^(-1),32.6%的样品TYMC超过10^(3)CFU·g^(-1),60.9%的样品可检出耐热菌;不含内脏组织动物饮片lg TYMC均值高于含内脏组织饮片(P=0.01),其TYMC检出不合格率高于含内脏组织组(χ^(2)=7.59,P=0.00);采收加工炮制过程中未经热处理样品lg TYMC均值高于热处理组(P=0.02),TYMC检出不合格率高于热处理组(χ^(2)=3.99,P=0.04)。13.0%(6/46)的样品检出耐胆盐革兰阴性菌,8.7%(4/46)的样品耐胆盐革兰阴性菌载量超过10^(4)MPN·g^(-1),8.7%(4/46)样品中检出大肠埃希菌,1批蝉蜕样品中检测到铜绿假单胞菌。样品TAMC载量与耐热菌载量呈相关性(P=0.00)。样品中共分离到55株典型菌,芽胞杆菌属细菌占47.3%,肠杆菌属细菌占23.6%,肠球菌占16.4%,样品中检出蜡样芽胞杆菌、阴沟肠杆菌复合体成员等条件致病菌。结论:含动物组织类饮片微生物负载水平高,耐热菌污染严重,耐胆盐革兰阴性菌污染率低,需氧菌负载与耐热菌负载水平具有相关性,饮片典型菌以芽胞杆菌属细菌污染最常见,但污染频率高的条件致病菌在动物饮片微生物控制中应引起足够重视。

药品微生物实验室水系统分离37株微生物的鉴定及分析

目的针对目前国内微生物实验室试验用水的实际情况,探索试验用水微生物群落的组成及分布规律。方法参考国内外药典对纯化水微生物的检验方法,收集某实验室7个纯水使用点的纯化水,经薄膜过滤法处理,采用R2A琼脂培养基培养、分离和纯化,并进行革兰染色。分别运用基因型鉴定方法(16S rDNA序列分析、Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统),生化鉴定方法(Biolog自动微生物鉴定系统)对检出微生物进行鉴定,并对实验结果进行分析比较。结果本研究共培养获得37株细菌,主要为鞘氨醇单胞菌属和叶杆菌属等。16S rDNA序列分析能对37株微生物达到属或属水平以上的鉴定,Biolog自动微生物鉴定系统鉴定出13株微生物,Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统鉴定出17株微生物。结论16S rDNA序列分析适合对水系统中的微生物进行基于培养的群落分布分析,Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统更适用于同种/属细菌的分型及溯源分析。

我国禽传染性支气管炎病毒分子流行病学研究进展

禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infec-tiousbronchitisvirus,IBV)引起的雏鸡和成年鸡呼吸系统以及泌尿生殖道组织损伤和病变的急性、高度接触性疾病。虽然临床上广泛使用疫苗免疫防控该病,但由于IBV基因组存在频繁的变异和重组,导致新基因型和血清型不断出现,从而造成我国鸡IB未能得到有效控制。文章详细介绍了基于IBVS1基因系统发育学建立的分型方法以及我国流行的IBV4个基因型、18个分支的来源、传播和流行现状,为IB防控和疫苗研发提供参考。

内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌的分离与鉴定

对内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌进行分离并鉴定。以蒙古族传统发酵乳为材料,采用传统的细菌纯培养分离方法分离乳酸菌株,通过形态学特征及生理生化试验初步确定乳酸菌的基础上,进一步利用细菌16S r DNA基因序列分析和系统发育进化树构建,对其种属进行分析鉴定。分析鉴定结果显示,分离得到的29株乳酸菌共鉴定为2个属,6个种。2个属分别为乳酸杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Entercoccus),6个种分别为短乳杆菌(Levilaccillus brevis,4株)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,8株)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis,9株)、鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum,3株)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii,1株)、耐久肠球菌(Enterococcus durans,4株)。该研究采集的发酵乳样品中乳酸菌资源丰富,代表着内蒙古蒙古族传统发酵乳制品中优势性乳酸菌菌种,为优良发酵剂的研发奠定了微生物资源基础。

白术疫霉拮抗链霉菌的筛选、鉴定及其抑菌效果

本文从河北省安国市白术疫病发生地块的健康白术植株的根际土壤中,分离筛选对白术疫霉Phytophthora sansomeana有拮抗作用的链霉菌菌株,旨在为白术疫霉病害的绿色防控提供有效的生防资源。采用稀释涂布法和平板对峙法,分离、筛选得到3株对白术疫霉拮抗效果较好的链霉菌菌株BZX-23、BZX-31、BZX-104。经16S rDNA序列分析,结合菌落形态特征、生理生化特征,将这3株拮抗链霉菌菌株分别鉴定为加利利链霉菌Streptomyces galilaeus、包比链霉菌S.bobili、苜蓿链霉菌S.alfalfae,其对白术疫霉的抑制作用均在60%以上。

新疆地区母乳中乳酸菌的分离鉴定及潜在益生菌的筛选

母乳是婴儿营养物质的主要来源且蕴藏着丰富的乳酸菌资源。为了了解新疆地区母乳中乳酸菌组成,筛选母乳中具有优良益生特性的双歧杆菌。该文通过传统纯培养方法对6份新疆地区母乳中的乳酸菌进行分离鉴定。以益生菌株Bifidobacterium lactis BB12作为对照,通过发酵特性、体外胃肠液耐受性及胆盐耐受性试验对双歧杆菌进行筛选,得到2株具有潜在益生特性的双歧杆菌,对其进行最适pH,最适温度,对NaCl的耐受性,生长曲线及菌株产酸能力等生理生化特性试验。从6份样品中共分离到69株乳酸菌,鉴定为7个属11个种及亚种,其中Streptococcus salivarius为优势菌,通过初步筛选获得2株具有潜在益生特性的双歧杆菌:Bifidobacterium longum IMAU99727和Bifidobacterium animalis subsp.lactis IMAU99728,有望作为新的母乳源益生菌进行其他益生特性研究和开发利用。

埃塞俄比亚发酵食品中乳酸菌的分离鉴定

采用传统纯培养方法对采集自非洲埃塞俄比亚地区的蜂蜜酒,咖啡,面引子等4份发酵食品中的乳酸菌进行分离纯化,运用16S rDNA序列分析和系统发育进化关系研究方法进行种属鉴定。结果表明,经16S rRNA基因序列分析,共分离到55株乳酸菌,分属于3个属,11个种或亚种,包括乳杆菌属(Lactobacillus)51株,肠球菌属(Enterococcus)3株,链球菌属(Streptococcus)1株,其中Lactobacillus paracasei为埃塞俄比亚地区蜂蜜酒中的优势菌株,占该样品总分离株的75%,Lactobacillus pontis为该地区面引子中的优势菌种,占该样品总分离株的41%。

阑尾炎并阑尾周围脓肿置管引流术后迟缓埃格特菌血流感染的诊断及治疗(附1例报告)

目的总结阑尾炎并阑尾周围脓肿置管引流术后迟缓埃格特菌血流感染的有效诊断及治疗方法。方法对1例阑尾炎并阑尾周围脓肿置管引流术后迟缓埃格特菌血流感染患者的诊治经过作回顾性分析。结果患者80岁,以右下腹疼痛伴发热入院,经实验室检查、腹部超声检查、腹部CT检查诊断为阑尾炎并阑尾周围脓肿,接受经皮穿刺阑尾周围脓肿造影及置管引流术治疗,术后以头孢唑肟进行抗感染治疗。术后4 h患者突发持续性寒战、体温升高、降钙素原升高,判断患者有血流感染表现,更换抗菌药物为头孢哌酮/舒巴坦经验性抗感染治疗。血培养结果提示患者为革兰阳性杆菌,血培养分离菌株经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析仪和16S rRNA基因序列分析均鉴定为迟缓埃格特菌。患者经头孢哌酮/舒巴坦抗感染治疗9 d后康复出院。结论阑尾炎并阑尾周围脓肿置管引流术后迟缓埃格特菌血流感染的主要临床症状是发热,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析和16S rRNA基因序列分析均可用于迟缓埃格特菌菌种鉴定,但鉴定时间较长,提前进行经验性抗感染治疗十分必要,头孢哌酮/舒巴坦是治疗阑尾炎并阑尾周围脓肿置管引流术后迟缓埃格特菌血流感染的有效抗菌药物之一。

海南天然饲草青贮饲料中乳酸菌分离鉴定及优良菌株筛选

为筛选适合热带牧草的高温发酵优良乳酸菌,改善青贮发酵品质,本试验从海南岛不同气候区采集野生草本植物斑茅(Saccharum arundinaceum)、蔓生莠竹(Microstegium vagans)和木本植物银合欢(Leucaena leucocephala)、构树(Broussonetia papyrifera),青贮60 d后分离纯化乳酸菌,以培养36 h条件下最终发酵液pH≤4且OD(Optical density,吸光度)≥2作为条件初筛乳酸菌。用温度T=40℃,45℃,50℃和pH=3.0,3.5,4.0,6.0,8.0,9.0进行复筛,选取OD值较高的菌株作为优势菌株,再对其进行16S rDNA序列分析、生长和产酸速率测定以及生理生化实验。结果表明,本试验共分离到98株天然乳酸菌,经筛选得到4株优良乳酸菌(15B,10D,13C,14B)。经鉴定,10D,13C,14B为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),15B为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。菌株15B,10D,13C,14B均耐酸、耐高温、且生长及产酸性能优良,具有良好的青贮潜力并对致病菌具有良好的抑制作用,可作为热带地区制备青贮添加剂的备选菌种。

布里亚特顿金斯克区发酵乳制品中乳酸菌分离鉴定

通过传统纯培养方法对采集自俄罗斯布里亚特共和国顿金斯克区的奶酪,酸牛奶,乳清,发酵乳饮料等8份发酵乳制品进行乳酸菌的分离纯化。经16S rDNA序列分析将50株乳酸菌鉴定为Lactococcus(20株)、Lactobacillus(12株)、Enterococcus(8株)、Pediococcus(5株)、Leuconostoc(3株)、Streptococcus(2株),共6个属,11个种。其中Lactococcus lactis为布里亚特共和国顿金斯克区发酵乳制品的优势菌株,占总分离株的40%。