Myc-Max作用序列启动子在c-myc过表达细胞中的特异启动活性

目的 探讨由Myc Max二聚体作用序列替代单纯疱疹病毒 (HSV)胸腺嘧啶 (TK)核苷激酶启动子第 3区后 ,形成的嵌合结构在c myc过表达细胞中的特异启动活性。方法 通过聚合酶链反应(PCR)产物克隆和一系列亚克隆技术 ,构建由Myc Max作用序列与HSV TK启动子部分区域组成的嵌合启动子 ,将荧光素酶报告基因置于其控制之下 ,构建成荧光素酶表达质粒 ,瞬时转染已经Northernblot证实的c myc过表达和低表达细胞系 ,检测细胞提取物中的荧光素酶活性。结果 在c myc过表达的PC 2和PC 7细胞中 ,嵌合启动子 (Mpr)启动表达的荧光素酶活性分别为 ( 81966±4 3 2 3 8)和( 70 5 63±2 2 4 3 5 )相对发光值 (RLU) ,为剩余TK部分启动子 (Epr)启动活性的 78倍和 15 0倍 ,并是完整TK启动子 (TKpr)的 6 7倍和 1 7倍 ;在c myc低表达细胞中 ,Mpr启动活性很弱 ,其启动的荧光素酶活性为 ( 4 3 1± 73 )RLU ,与Epr启动的荧光素酶活性 ( 60 1±14 1)RLU近似。结论 由Myc Max蛋白作用序列与TK部分启动子组成的嵌合结构在c myc过表达细胞中具有特异启动活性。

牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析

根据G enB ank中已公布的人、猪和小鼠的MyoG基因的5′侧翼和部分第一外显子序列设计PCR引物,用touch-dow n PCR技术扩增了牛MyoG基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGEM-T-MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,牛MyoG基因的启动子序列(G en-bank中注册号为AY 882581)长度为672 bp,其与猪、人和小鼠相应序列的同源性分别为94%,91%和88%,且其在不同物种之间具有一定的保守性。牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析为进一步研究牛MyoG基因的表达调控奠定了基础。

组蛋白与转录因子在hAMFR基因启动子序列上的结合及相互作用

采用从鸡红细胞中分离纯化的组蛋白H1、核心组蛋白H2A＋H2B和H3＋H4，以及从HeLa细胞中萃取的含有RNA聚合酶Ⅱ和多种Ⅱ类基因转录因子的可溶性HeLa细胞核抽提物，通过凝胶迟滞电泳，对组蛋白和HeLa细胞核抽提物中的转录因子在人自泌移动因子受体（Humanautocrinemotilityfactor，简称为hAMFR）基因上游启动子序列的相互作用关系进行了初步研究，得到以下结论：组蛋白Hl对hAMFR基因启动子序列的结合是相对稳定的，H1在稳定染色质小体中起着重要的作用。组蛋白及其组份和转录因子可以同时结合在hAMFR基因启动子序列上形成三元复合物，提示转录因子和组蛋白在与DNA竞争结合过程中不是简单地排斥对方。

木薯低温诱导基因MeLTI6A的启动子的克隆与序列分析

MeLTI6A(Manihot esculenta low temperature inducible 6A)是木薯低温干旱诱导基因,本研究从MeLTI6A的序列出发,利用电子克隆设计引物进行PCR扩增的方法获得该基因的启动子,其序列共1 304 bp。生物信息学分析发现该启动子中具有真核生物典型的核心启动子区(TATA-box和CAAT-box),并利用α-互补,蓝白斑筛选原理验证了该启动子核心序列具有活性;该启动子具有与干旱胁迫相关的激素类(如脱落酸、乙烯)的响应元件和逆境胁迫(如低温、干旱胁迫)的响应元件;还具有与木薯组织特异表达相关的调控元件和其它光响应元件;并通过Real time PCR检测了低温胁迫(4℃)下的木薯组培苗中MeLTI6A的表达变化,说明了该启动子区的低温胁迫顺式作用响应元件可能调节MeLIT6A在低温胁迫下的表达。这些说明木薯的MeLIT6A基因可能是通过对干旱胁迫激素信号响应以及逆境胁迫响应起作用,使木薯获得一定的抗胁迫的能力,同时还可能参与了木薯相关组织发育过程的调控。本研究有利于对MeLTI6A基因抗逆境胁迫功能的理解,为探索木薯高效抗逆的分子机制作初步研究。

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Sc-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得Sc-ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82%和80%。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA-BOX和CAAT-BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。

角膜与三叉神经节内HSV1潜伏相关转录启动子的核苷酸序列分析

目的 比较角膜与三叉神经节 (TG)内单纯疱疹病毒Ⅰ型 (HSV 1)潜伏相关转录 (LAT)启动子序列 ,进一步证实角膜为HSV 1的另一潜伏地。方法 用新西兰白兔建立HSV 1潜伏感染动物模型 ,提取并PCR扩增角膜及TGLAT启动子 ,比较LAT启动子序列。结果 6 6 7% (4/6 )的角膜组织扩增出HSV 1LAT启动子 ,且与TG的电泳位置相同 (2 16bp) ;其在 2～ 16 1间的核苷酸序列完全相同。结论 HSV 1潜伏期的角膜组织存在LAT启动子 ,并与TG内的序列相同 ,表明角膜在很大程度上与TG一样 ,是HSV 1的另一潜伏点。

一种改良的启动子序列克隆的染色体步查法

利用染色体步行法,从已知DNA序列克隆侧翼未知序列是非常有效的方法之一,但由于所选用的特定限制性内切酶对目标基因组不能酶解成合适大小的片段,因而受PCR扩增能力的局限,往往扩增不出有效产物.针对这一点,这里我们介绍一种简单有效的改良方法,它包括以下步骤:首先用不同的限制性内切酶(包括平末端和粘性末端)酶解目标基因组DNA,接着,选择能将基因组酶切成弥散、分布均匀的限制性内切酶,如DraⅠ和HindⅢ,合成相对应的接头;然后,选择弥散的、分布均匀的限制性内切酶的酶解产物,构建成含相应接头的基因组DNA文库,用作PCR的模板;最后,用接头引物和特异引物,通过巢式PCR扩增目的片段,获得了理想的扩增效果.采用改进后的染色体步查法,有效地从较复杂的棉花核DNA中克隆出6个棉花启动子序列.

水稻白叶枯病菌hrpF启动子序列调控的绿色荧光蛋白基因表达体系的构建

为了阐明启动子序列对水稻白叶枯病菌效应子基因表达的调控作用及特征,通过融合PCR将报告基因GFP基因置于水稻白叶枯病菌hrpF基因启动子序列的下游,经酶切、PCR鉴定及序列测定,成功构建了受hrpF启动子序列调控的GFP基因转录单元pMF-GFP,并转入JXO I菌株中。结果发现构建的hrpF::GFP转录单元,在hrp诱导培养基XOM2上可有效诱导表达,而在NA培养基上不能诱导表达。结果还显示,在大肠杆菌中,中间表达载体phrpF::GFP具有GFP表达活性。

甘肃马鹿肌细胞生成素(MyoG)基因启动子区序列克隆与分析

MyoG基因在肌肉发生过程中具有中心调节作用。根据GeneBank中已发表的猪、人、小鼠和牛的MyoG基因5'侧翼和部分第1外显子序列设计PCR引物,采用Touch-Down PCR技术扩增了甘肃马鹿MyoG基因的启动子区序列,构建了重组克隆载体pMD18-T-MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,甘肃马鹿MyoG基因启动子区序列长685bp,其与猪、人和小鼠的同源序列相似性分别为88.1%、84.9%和82.6%,且不同物种间保守性较强。本研究为进一步探讨甘肃马鹿MyoG基因的表达与调控机制奠定了基础。

米曲霉菌AFLR基因启动子序列的克隆

目的 从米曲霉菌中克隆 AFL R基因启动子序列 ,为进一步开展有关研究以深入阐明曲霉菌产生黄曲霉毒素的机制打下基础。方法 应用分子生物学手段从基因文库中克隆目的基因 ,对克隆基因进行了限制性酶谱分析 ,再对启动子序列进行亚克隆并进行了序列测定。结果 从米曲霉菌 ATCC 14895基因文库中克隆获得含 AFL R基因的 8.3kb DNA片段。对该基因片段进行了限制性酶谱分析并绘制了限制性酶切图谱。根据酶谱分析结果 ,将其中 42 0bp片段亚克隆至 p BS 质粒中 ,获得重组质粒 p AP1.1。结论 序列分析结果表明我们成功地从米曲霉菌中克隆了AFL

日本血吸虫精氨酸酶基因启动子序列的扩增及序列分析

目的获取日本血吸虫(Sj)精氨酸酶(ARG)新基因的DNA编码序列及其启动子序列,实验验证ARG基因编码序列的完整性。方法以日本血吸虫成虫DNA做模板,PCR扩增ARG基因编码区的DNA序列并测序;根据SjARG基因已扩增的DNA序列设计2条巢式引物,用TaKaRaLATaqPCRCloninginvitroKit,扩增SjARG基因的启动子序列;对已扩增得到的序列进行TATA盒的寻找以分析启动子序列的位置,实验验证我们曾获取的SjARG新基因编码序列的完整性。结果扩增得到长约1000bpARG基因DNA序列,SjARG基因DNA序列内没有内含子,与cDNA序列完全一致。对启动子序列扩增后,得到一略大于250bp的序列,测序后分析发现其中有36bp与ARG基因DNA序列的5'端重叠。因此,将精氨酸酶基因的DNA序列又向前延伸了221bp,与前面得到的序列拼接后得到一条1486bp的总序列,将该序列在NCBI上进行ORF的寻找发现其最长的ORF达1164bp,起始密码子在第156位,终止密码子在第1319位,该起始密码子前32位为TATA盒的位置。因此,确定该SjARG基因全长cDNA编码序列长应为1164bp。结论成功扩增获得了日本血吸虫精氨酸酶基因编码区的DNA序列,其不含有内含子;并扩增得到了该基因的启动子序列,从而获得了SjARG基因真正的全长cDNA序列,为进一步的功能鉴定奠定了基础。

拟南芥AtSWEET4基因启动子序列、编码蛋白结构分析及其在病原菌胁迫下表达特性检测

【目的】分析拟南芥糖运输载体蛋白基因(AtSWEET4)启动子序列及其编码蛋白的结构,并检测病原菌胁迫下AtSWEET4基因的表达特性,为研究AtSWEET4蛋白在拟南芥生长发育和生物胁迫中的作用机制提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法分析AtSWEET4基因启动子序列及其编码蛋白的结构,并采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织染色法检测人工接种菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringae pv. phaseolicola,Psp)NPS3121和丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000后AtSWEET4基因的表达情况。【结果】AtSWEET4蛋白由251个氨基酸组成,分子量为27.8 kD,分子式为C1300H2038N304O346S11,理论等电点(pI)为8.71,脂肪氨基酸指数为118.76,不稳定指数为38.72,平均亲水性指数为0.629,为稳定的亲水蛋白,且含有7个跨膜结构域,无信号肽,为非分泌型蛋白。AtSWEET4蛋白与芥属的亚麻荠和荠菜SWEET4蛋白亲缘关系最近,其次是十字花科的甘蓝和萝卜SWEET4蛋白,与禾本科的二穗短柄草SWEET4蛋白亲缘关系最远。AtSWEET4基因启动子序列中包含核心元件TATA-box、增强子元件CAAT-box、调控植物生长发育相关元件、激素响应相关元件、非生物胁迫响应相关元件和生物胁迫响应相关元件。Psp NPS3121和Pst DC3000均可诱导AtSWEET4基因表达,但表达模式不同:接种Psp NPS3121后6和12 h的AtSWEET4基因表达明显上调,但至接种后24 h又迅速下降;接种Pst DC3000后AtSWEET4基因表达量逐渐增加。【结论】AtSWEET4基因的启动子序列特征及其编码蛋白结构与其参与植物免疫反应密切相关。

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达的启动序列ISRE4(4个串联的ISRE序列)和GAS7(7个串联的GAS序列),与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-EnhancerGAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。

σ^(38)识别的启动子-35区核酸序列特征研究

依据部分资料假定大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶的σ３８亚单位在特异启动子的－３５区识别的保守序列是－ＴＣＴＣＣＣ－，合成用其它碱基分别取代这一区域每一个碱基的引物，以ｏｓｍＹ基因片段为模板，通过ＰＣＲ扩增成－３５区含不同碱基序列的转录模板，用体外重组的由σ３８和核心酶（Ｅ）组成的全酶（Ｅσ３８）对这些启动子进行体外转录．结果显示含－ＴＣＴＣＣＣ－序列的启动子的转录水平既低于原始的ｏｓｍＹ启动子，又低于经ＰＣＲ扩增的其它序列．综合研究结果推测，这一区域的保守序列是－ＴＣＴＣＴＣ－．

柁果MiLCYB2基因启动子的克隆与序列分析

目的：了解卡亡果MiLCYB2基因的表达调控规律。方法：应用染色体步移方法克隆了991bp的MiLCYB2基因启动子序列。结果：用在线软件PlantCARE分析表明，该序列除含有启动子基本元件，如TATA-BOX、CAAT-BOX外，还含有ABA、GA、Auxin、SA、MeJA多种植物激素响应元件，以及参与生理周期调控、MYBHvl结合位点和光响应元件等一些其他的调控序列，推测MiLCYB2基因的表达受多种植物激素、光照、生理周期、MYBHvl转录因子等的调控。

野蚕DHPBAN基因启动子的克隆及序列分析

为研究昆虫滞育激素性信息素合成激活肽基因在进化过程中的变化以及基因表达调控的异同，用ＰＣＲ方法克隆了野蚕的ＤＨＰＢＡＮ基因的启动子并测序，这是第二个被克隆的昆虫ＤＨＰＢＡＮ基因启动子．与家蚕相比，在核苷酸水平上同源性达９４％．野蚕ＤＨＰＢＡＮ基因启动子的ＴＡＴＡ框的保守序列为ＴＡＴＡＴＡＡＡ，位于－４７—－４０处；ＣＡＡＴ框是ＧＧＣＣＣＡＴＣＴ，位于－８３—－７５处；野蚕与家蚕一样具有ＴＡＡＴ保守序列，这段序列是一类调控蛋白的结合核心位点，家蚕的位于－１８５—－１７６，野蚕的位于－１７６—－１６７．在－６４—－５６部位，核苷酸序列表现出较大的不同．

鸭Ccna1启动子克隆、序列分析及在鸭骨骼肌中的发育性表达

为研究Ccna1基因在鸭骨骼肌发育中的作用,本研究应用RT-PCR扩增和克隆了鸭Ccna1基因启动子区并作生物信息学分析,应用荧光定量PCR技术检测Ccna1基因以及参与该基因表达调控的多个肌源性转录因子在鸭胚骨骼肌组织发育过程中的表达模式。结果表明,扩增得到鸭Ccna1基因启动子2 213bp。序列分析表明,鸭Ccna1启动子存在典型的TATA-box、CAAT-box调控元件,有MyoD、MRF4、MyoG、Sp1、PITX1及MEF2等多个转录因子结合位点。定量结果发现,MyoD、MRF4、MyoG和Ccna1在鸭胚胎骨骼肌发育过程中均有表达。在鸭胸肌中,MRF4在E23时期表达量最高,显著高于D8的表达量(P<0.05);在腿肌中,MRF4和MyoG表达量在E17时期达到最高,且显著高于D2、D8(P<0.05)。聚类分析表明,在鸭胸肌组织中Ccna1表达模式与MyoD一致,在腿肌组织中Ccna1表达模式与MRF4、MyoG一致。初步推测,Ccna1参与到了鸭骨骼肌组织的发育,且在鸭腿肌的生长发育中,MRF4、MyoG可能与Ccna1相互作用进而调控骨骼肌发育,而在鸭胸肌组织中,Ccna1的表达可能与MyoD的转录调控有关。

小麦TaDEP1基因启动子区转录增强序列的鉴定

RNAi干涉小麦TaDEP1基因导致小穗密度下降以及小穗数减少,表明该基因转录水平的降低会引起基因功能的丧失。为挖掘影响TaDEP1转录水平的作用元件,通过特异扩增D组TaDEP1基因启动子并进行测序,发现不同品种间存在132 bp序列差异,该序列位于TaDEP1基因起始密码子上游1529~1660 bp处。利用小麦微核心种质材料,鉴定到132 bp序列与TaDEP1基因的转录水平呈正相关,即启动子序列中含有132 bp序列的TaDEP1基因转录水平明显高于不含该序列的转录水平。启动子顺式作用元件分析结果显示,该132 bp序列未包含特殊的顺式作用元件。结合荧光素酶(LUC)活性试验,在小麦原生质体中证明该序列能够显著提高LUC的转录活性,表明该序列可作为小麦基因转录增强序列。本研究鉴定到新的小麦基因转录增强序列,为小麦分子标记辅助选择育种提供了基因资源与技术支持。

46，XY女性的SRY基因启动子序列的突变研究

采用非同位素ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术对６例４５，ＸＹ女性的ＳＲＹ基因的启动子序列进行突变分析。结果表明，患者ＳＲＹ基因的启动子序列均未发生突变。推测某些４６，ＸＹ女性患者在其ＳＲＹ基因ＨＭＧ盒序列及启动子序列均无突变发生的情况下，可能存在与性分化有关的其它基因的突变，从而导致性反转。