应用银染端粒重复序列扩增法检测人肝癌细胞系端粒酶活性的研究

观察人肝癌细胞的端粒酶活性。应用非放射同位素银染的端粒重复序列扩增法（ＴＲＡＰ），检测６株人肝癌细胞株（ＢＥＬ－７４０２，ＨｅｐＧ２，ＱＧＹ－７７０１，ＱＧＹ－７７０３，ＳＭＭＣ－７７２１，ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）的端粒酶活性，同时检测ＲＮａｓｅ处理的阴性标本。６株人肝癌细胞的端粒酶均为阳性。

检测端粒酶活性的端粒重复序列扩增法的初步建立

端粒是真核线性染色体末端结构,人端粒DNA由(TTAGGG)n重复序列组成.端粒酶是核糖核酸蛋白酶,具有RNA依赖的DNA合成酶活性,可重新合成端粒的重复序列.最近研究证实端粒及端粒酶与细胞衰老及肿瘤相关,是近年来生物学研究的热点.检测端粒酶活性是研究端粒酶的基本方法,同时具有潜在的临床诊断价值.本文拟应用最新的端粒重复序列扩增法(Telomeric Repeat AmplificationProtocal,TRAP),检测肝癌细胞端粒酶活性.

应用端粒重复序列扩增法检测原发性肝癌组织端粒酶活性的研究

目的:检测原发性肝癌及癌旁组织端粒酶活性并探讨端粒酶活性在原发性肝癌中的临床意义。方法:应用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测36例原发性肝癌及癌旁组织和3例正常肝组织端粒酶活性。结果:36例原发性肝癌组织有29例(80.6%)阳性。而36例癌旁组织只有4例(11.1%)阳性。3例正常肝组织均阴性。4例癌旁组织端粒酶阳性的患者均于术后半年内复发。结论:原发性肝癌癌旁组织端粒酶活性可望成为预测原发性肝癌术后复发的重要指标,对患者术后治疗方案的选择以及术后随访观察具有一定的指导意义。

银染端粒重复序列扩增法检测肺癌端粒酶活性

目的 评价端粒酶能否作为肺癌诊断的一个肿瘤标志物。方法 采用改良的银染端粒重复序列扩增法 (TRAP)检测 34例人肺癌手术标本 (包括癌组织、相应癌旁组织与正常组织标本各 34份 ,2 8个相应淋巴结 )的端粒酶活性。另有肺囊肿、肺炎性假瘤各 3例作为对照。结果 88.3% (30 / 34 )的肺癌癌组织端粒酶阳性 ,正常组织全部阴性。结论 端粒酶可以作为肺癌诊断的一个肿瘤标志物 ,改良的银染TRAP法成本低、污染少 。

银染端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性及其临床应用

目的 建立银染端粒重复序列扩增法(TRAP)测定肿瘤细胞的端粒酶活性.方法:将银染与TRAP相结合,测定了人肿瘤细胞株及穿刺细胞标本的端粒酶活性.结果:人肿瘤细胞株端粒酶活性为阳性,35例病理诊断为恶性肿瘤的穿刺标本中,33例端粒酶活性阳性,12例良性病变均为阴性.结论:银染TRAP法是特异,敏感及快速的端粒酶活性的检测方法,提示该方法可成为恶性肿瘤的诊断指标之一.

端粒重复序列扩增-银染色法用于端粒酶活性测定的研究

目的 :建立端粒重复序列扩增 (TRAP) -银染色技术 ,探讨端粒酶活性检测在肿瘤诊断中的意义。 方法 :用裂解液提取组织细胞中的端粒酶模板 ,在特异引物作用下进行 PCR扩增 ,所得产物用氯仿∶异戊醇 (2 4∶ 1)处理浓缩 ,作聚丙稀酰胺凝胶垂直板电泳 ,经硝酸银染色分析端粒酶活性。 结果 :TRAP-银染色法能准确特异地检测小鼠骨髓瘤细胞 (SP2 / 0 )的端粒酶活性 ,灵敏度可达 1× 10 2个细胞。端粒酶阳性率在 2 3例各种恶性肿瘤组织中为 86 .9% (2 0 / 2 3) ,而在 19例炎性包块与良性增生组织为 5 .3% (1/ 19) ,5例正常组织中未发现有端粒酶活性。 结论 :TRAP-银染色法简便快速、具有较好的测定敏感度与重复性 ,对临床恶性肿瘤疾病的诊断具有良好的应用前景。

银染端粒重复序列扩增法检测肝癌模拟肝穿组织端粒酶活性的研究

目的:探讨细针穿刺肝活检组织行端粒酶活性检测用于肝细胞癌(HCC)诊断的可行性。方法:HCC共28例,每例HCC肿瘤切除后立即行肝肿瘤模拟细针穿刺。应用非放射性同位素银染的端粒重复序列扩增法(TRAP),分别对28例模拟肝穿组织和28例肿瘤切取组织行端粒酶活性检测。结果:模拟肝穿组织与肿瘤切取组织的端粒酶检测结果完全一致,阳性率均为82%(23/28)。结论:模拟肝穿组织与肿瘤切取组织在HCC端粒酶活性检测方面具有同等的效果。该结果提示,B超引导下经皮肝穿刺活检行端粒酶活性检测在HCC的诊断、治疗效果评价和预后的判断方面具有一定的应用前景。

依赖核酸序列扩增技术检测呼吸道合胞病毒方法的建立

目的建立依赖核酸序列扩增技术(NASBA)检测呼吸道合胞病毒(RSV)的方法。方法依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库,利用Primer 5软件进行RSV特异性引物设计。收集经免疫荧光法检测确认RSV阳性的咽拭子样本,以同批检测RSV阴性样本作为阴性对照。优化样本处理条件和扩增反应体系,建立NASBA检测RSV的方法,并与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行比较。结果采用直接冻融法处理咽拭子样本,取上清检测;引物设计原则为引物加T7启动子序列。NASBA在RSV RNA标准品浓度为2.81×102拷贝/μL时仍能检测出目的片段,而RT-PCR在2.81×104拷贝/μL时目的条带隐约可见,提示NASBA的灵敏度比RT-PCR高出至少100倍。NASBA在7例RSV阳性咽拭子样本中特异性扩增出RSV RNA,而在其他病毒阳性(包括流感病毒A阳性2例、副流感病毒3阳性2例、腺病毒阳性1例)及RSV阴性(3例)样本中未见目的条带,提示NASBA的特异性较高。结论建立的NASBA特异性强、灵敏度高、耗时相对较短,克服了目前实验室病毒检测方法的局限性,为RSV的检测提供了有效的实验室检测手段。

端粒重复序列扩增法结合微孔板杂交法定量检测端粒酶活性

目的探讨定量检测端粒酶活性的非放射性检测方法。方法将端粒重复序列扩增测定法（ＴＲＡＰ）与微孔板杂交 相结合建立了非放射性检测方法，对３例正常肝组织和４例肝癌患者治疗前后的肝癌组织、瘤旁组织、肝癌凋亡组织 进行检测。结果肝癌组织具有比较高的端粒酶活性，而正常肝组织和瘤旁组织无此酶活性，肝癌凋亡组织端粒酶活性 显著降低。结论 该定量分析方法简单、灵敏、特异性强，可以比较准确地反映组织的端粒酶活性状态。

一株酿酒酵母的特征区域序列扩增标记

以23株不同来源的酿酒酵母为研究对象,分别提取基因组DNA,试用50条随机引物对其进行随机扩增多态性DNA分析,筛选到两条具有菌株鉴别能力的随机引物。P09可以从2.412,ST—01,SK—26,ZD—01四株酿酒酵母基因组DNA中扩增出长度为433bp的Sc—433片断Sc—433;P46可以从2.1882,ST—01,NJ—02三株酿酒酵母基因组DNA中扩增出长度为665bp的Sc—665片断,其中仅有目的菌株ST—01能稳定的扩增出这2个标记。把这2个片断分别克隆到pUCmT质粒载体中,经过酶切鉴定后测序,根据序列设计特异性引物,把RAPD标记转化为特征区域序列扩增标记,为酿酒酵母菌株的分子鉴别提供了新的借鉴。

番茄抗花叶病毒基因类似序列扩增研究

[目的]研究番茄抗花叶病毒基因类似序列扩增。[方法]以选育和生产上广泛使用的20个番茄品种为试材,对其进行了田间和实验室抗花叶病毒病(ToMV)筛选、基因类似序列扩增、RAPD聚类分析及特异引物PCR扩增。[结果]美味樱桃番茄、中杂9号、早红宝、W262-4、OH-2-2-11、黄圣果和美国番茄对ToMV具有较强的抗性;根据聚类分析,受试品种可分为3类,从中选出9个抗性和非抗性品种进行抗ToMV基因类似序列分析,其中非抗性和购买无抗性番茄品种未扩增出任何谱带,而抗性品种扩增出约300 bp的谱带,初步认为该谱带为抗ToMV类似序列基因。[结论]为培育抗花叶病毒病的番茄品种提供了理论依据。

端粒重复序列扩增法检测胃癌组织中端粒酶活性研究

目的 :研究胃癌组织、癌旁及远端正常胃组织中的端粒酶活性 ,探讨其作为胃癌肿瘤标记物的可能性。方法 :采用TRAP-ELISA法检测了 5 1例胃癌组织、癌旁及远端正常胃组织的端粒酶活性表达。结果 :5 1例胃癌组织中端粒酶阳性表达 48例( 94.1%) ,癌旁组织为 17例 ( 3 3 .3 %) ,远端正常胃组织未检测出端粒酶活性。结论 :端粒酶是特异性较强的恶性肿瘤基因标志 ,有可能成为胃癌早期诊断和治疗的理想标记物。

SYBR Green实时定量端粒重复序列扩增法检测端粒酶活性

目的采用实时定量端粒重复序列扩增法(RQ-TRAP法)检测不同细胞端粒酶活性。方法用RQ-TRAP和TRAP-ELISA两种方法同时检测12种细胞的端粒酶活性,并比较两种方法的检测结果。结果 RQ-TRAP方法能准确特异地检测系列稀释的293T细胞蛋白提取液的端粒酶活性,灵敏度可达8个细胞,扩增效率为98.92%。阴性对照组则未检测到端粒酶活性。RQ-TRAP方法测得12个细胞系中端粒酶的活性与TRAP-ELISA方法结果有较强相关性(r2=0.762 5)。两种方法检测肿瘤细胞端粒酶活性均高于正常细胞。结论 RQ-TRAP方法检测端粒酶可行,比TRAP-ELISA方法成本低、时间短,且支持高通量,是一种新的可快速可靠定量端粒酶活性的方法。

三核苷酸重复序列扩增与精神系统疾病

三核苷酸重复序列扩增是三核苷酸重复序列的拷贝数在世代传递中逐渐增加的一种基因动态突变,现已发现近20种疾病的发生与这一突变相关。本文就近年来国际上关于三核苷酸重复序列扩增与精神系统疾病研究的一些成果进行综述,主要内容包括:①三核苷酸重复序列扩增相关疾病的分类;②三核苷酸重复序列扩增与疾病的早现遗传现象;③三核苷酸重复序列扩增与精神系统疾病的发病机制研究;④精神系统疾病相关基因内三核苷酸重复序列的研究。

依赖于核酸序列恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立

为建立副溶血性弧菌的快速检测方法,本研究采用依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)技术,以副溶血性弧菌的tlh基因为扩增的靶基因设计特异性引物和探针,建立可快速扩增副溶血性弧菌的NASBA方法。特异性和灵敏度试验结果表明:该NASBA方法对副溶血性弧菌的最小检出量为5.1×102 cfu/mL,高于普通PCR方法,而且与其他种属的菌无任何交叉反应。此外,本研究将副溶血弧菌扩增产物采用通用型核酸扩增物快速检测板进行检测,实现了特异性强的快速副溶血弧菌的检测。该方法对仪器要求低,具有良好的应用前景。

沙门氏菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖于核酸序列恒温扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)检测体系,对沙门氏菌进行检测。采用沙门氏菌的invA基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测沙门氏菌的NAS-BA检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立起的NASBA检测方法,灵敏度为7.1×102cfu/ml,高于普通PCR方法。

核酸序列依赖扩增联合分子信标对曲霉菌感染的检测效果

目的建立快速、灵敏、特异的定量检测曲霉菌感染的诊断方法。方法以烟曲霉菌、黄曲霉菌及黑曲霉菌的孢子配制菌液,提取RNA后,采用核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)联合分子信标(molecular beacon,MB)技术进行荧光检测,并对该方法进行灵敏度和特异性分析。结果扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与标本中霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-10.7x+81.6,r=0.988)。将含有梯度数量霉菌孢子的标本提取总RNA后进行检测,可建立相应标准曲线。该方法的灵敏度可达到1个孢子;对照菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌)与曲霉菌提取总RNA经扩增后的产物进行电泳分析,发现仅曲霉菌出现特异性条带。结论 NASBA结合分子信标检测曲霉菌具有灵敏度高、特异性强的特点,具有潜在利用价值,有望成为曲霉菌感染的临床诊断方法。