中国汉族人群AZFc微缺失区域序列标签位点的探讨

目的:探讨中国人群无精子因子c(azoosperm ia factor c,AZFc)微缺失的类型及AZF多重PCR筛查时序列标签位点(sequence taged sites,STSs)的选择。方法:采用多重PCR反应测定9个STS位点(sY84、sY86、sY127、sY134、sY152、sY145、sY255、sY254、sY157)筛查164例严重少精子症或非梗阻性无精子症汉族男性Y染色体微缺失,并以精子浓度正常的男性105例作为对照;同时对来自多中心的180例已确诊为sY254、sY255缺失的男性进行sY145、sY152和sY157位点分析。结果:164例严重少精子症或无精子症男性中AZFc缺失者14例(8.5%);共194例sY254、sY255缺失男性的sY145、sY152均未缺失,而sY157未缺失者仅2例。发现1例单sY157缺失的严重少精子症男性为sY1206缺失和DAZ基因中DAZ3/DAZ4基因拷贝缺失。结论:sY254、sY255和sY157缺失是中国人群AZFc缺失的最常见类型;sY145和sY152微缺失在入选的研究对象中未曾出现,因此不建议作为AZFc常规筛查的位点。"sY157的单一缺失"可能是中国人群AZFc部分缺失的一种新类型,其临床意义值得进一步探讨。

利用DNA池和变性高效液相色谱分析bcr和abl基因序列标签位点多态性

为了探讨bcr和abl基因的单核苷酸多态性(SNP)与慢性髓细胞性白血病(CML)的关系,利用DNA池(DNApooling)结合变性高效液相色谱(dHPLC)技术对bcr和abl基因上的9个序列标签位点(sequencetaggedsite,STS)进行序列变异的筛查分析,并通过测序对筛查结果进行验证。研究结果表明,在9个STS片段中检出了4个片段中的多态性位点和3个片段中与参考序列不一致的变异。结论:U07000片段中的SNP在慢性髓性细胞白血病病人和对照人群中的基因频率分布有显著差异。

新疆向日葵自交系序列标签位点SSR多态标记库的构建研究

随机合成了500对向日葵SSR引物,利用这些标记对16份新疆食葵和油葵自交系进行了多态筛选。结果表明62对标记在16份向日葵基因组中扩增呈现稳定多态,扩增产物条带清晰、稳定和易读,占所合成引物数量的12.4%。这些标记可以作为新疆向日葵自交系和品种等真伪鉴定、杂种优势群划分分析等优先选用引物。

男性不育和性发育异常病例中27个序列标签位点的应用价值

目的:探讨27个序列标签位点(STS)检测在男性不育和性发育异常疾病中的应用价值。方法:收集2019年10月至2020年8月到河南省人民医院就诊的不育、性发育异常、性功能异常、尿道下裂、两性畸形等或超声提示胎儿生殖器官发育异常的91例患者(其中社会性别为女性5例,社会性别为男性85例,胎儿1例)。采用琼脂糖凝胶电泳检测技术对样本进行Y染色体无精子因子(AZF)微缺失检测;运用27个STS,采用复合荧光多重PCR毛细管电泳DNA片段分析技术对AZF微缺失与性染色体倍型拓展检测;G显带染色体核型分析技术对样本进行核型分析;比较基因组杂交芯片(aCGH)分析验证2例特殊病例。结果:琼脂糖凝胶电泳检测显示AZF微缺失总体异常检出率为11.0%,运用27个STS进行的AZF微缺失与性染色体倍型拓展检测方法显示总体异常检出率为26.4%。G显带染色体核型分析结合aCGH检测结果与运用27个STS进行的AZF微缺失与性染色体倍型拓展检测结果相互印证。结论:运用27个STS对AZF微缺失和性染色体数目等异常进行同时检测,提高了检出率,能更好地指导临床诊疗。

X染色体长臂末端28个新序列标签位点的分离

用脉冲场凝胶电泳分离回收覆盖脆性X位点的酵母人工染色体YAC209G4中475kb片段，经MboⅠ完全酶解为平均长度400bp的片段，与pBSⅡKS质粒载体重组，共得到3500个重组作，筛选出60个含单拷贝序列插入片段的克隆。经序列测定，并与基因数据库分析比较，其中28个序列被基因数据库接受为新的序列标签位点，GenBank收录号为U26560-U26587。根据其中3个新序列标签的核普酸顺序设计PCR引物，在人基因组DNA中扩增出相应的特异片段。

无精子症患者Y染色体序列标签位点-聚合酶链反应与二代测序检测的比较

目的观察无精子症患者Y染色体序列标签位点-聚合酶链反应(STS-PCR)与二代测序(NGS)检测的差异。方法对133例无精子症患者,采用STS-PCR检测Y染色体AZF微缺失的15个STS位点,包括AZF a区的sY84/sY86、AZF b区的sY124/sY127/sY128/sY133/sY134/sY143/sY1192、AZF c区的sY152/sY239/sY242/sY254/sY255、AZF b/c区的sY145,同时采用NGS检测Y染色体基因组拷贝数变异(CNVs),并统计分析两种检测方法的差异。结果133例无精子症患者中,Y染色体AZF微缺失异常17例(12.78%),其中缺失14个STS 1例,占5.88%;缺失12个STS 3例,占17.65%;缺失11个STS 1例,占5.88%;缺失6个STS 1例,占5.88%;缺失5个STS 1例,占5.88%;缺失4个STS 2例,占11.76%;缺失2个STS 1例,占5.88%;缺失1个STS 7例,占41.18%。Y染色体CNVs异常12例(9.02%),其中既重复又缺失3例,占25%;重复(dup)4例,占33.33%;缺失(del)5例,占41.67%。Y染色体AZF(15个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比,差异有统计学意义(P<0.05),而Y染色体AZF(经典6个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比,差异无统计学意义(P=0.357)。结论STS-PCR和NGS互有补充,前者不能检测出重复,后者可能漏检小片段缺失。在无精子症遗传因素的实验室检查中,可以考虑采用NGS作为筛选,而采用STS-PCR作为验证。

1例嵌合型Klinefelter综合征患者细胞与分子遗传学研究

目的:观察嵌合型Klinefelter综合征的外周血染色体、Y染色体上SRY基因和AZF基因微缺失发生情况。方法:对1例嵌合型Klinefelter综合征患者及父母进行外周血染色体核型分析,确定9个实验用序列标签位点(STS),分别是:sY84、sY86、sY127、sY129、sY134、sY254、sY255、sY242、sY152,同时检测SRY基因,并以X/Y连锁锌指蛋白基因(ZFX/ZFY)为内对照进行多重PCR筛查AZF微缺失。结果:患者核型为46,XY/47,XXY/48,XXYY/49,XXXXY,其中48,XXYY占56%;47,XXY占30%;46,XY占12%;49,XXXXY占2%,患者父母核型正常;患者及父母SRY基因检测与染色体性别一致,患者检出Y染色体AZF微缺失,缺失位点为sY86和sY127,缺失类型为AZFa+AZFb缺失。结论:Klinefelter综合征患者存在Y染色体AZF微缺失,染色体核型分析和Y染色体AZF微缺失是Klinefelter综合征患者重要的遗传检测指标。

SSR和STS标记在花生栽培品种鉴定中的应用研究

采用10份花生品种材料,对通过数据库查询设计合成的SSR引物和其他作者发表的SSR引物及STS引物进行了评估,并基于品种间简单匹配系数做了聚类分析。获得62个能产生多态性片段的SSR和STS引物对,总共获得427条带,其中291条(68.1%)为多态性带。平均每对引物产生6.88条带,4.69条为多态性带;多态性条带比率为16.7%～100%,PIC值为0.254～0.952,平均为0.760。9对SSR/STS引物,即Lec1、Ah426、Ah44、SsS14、SHPAL1、PG71、PG43、PM36、PG22,对所采用的10份花生品种区分率达到100%。说明SSR和STS标记应用于花生品种鉴定有效。

极大节旋藻（Arthrospiramaxima）高分子量基因组文库构建及其应用

构建了极大节旋藻fosmid文库。该文库含有4300个克隆，重组率是100％，插入片段集中在30～36kh之间，平均为33kb，覆盖率为节旋藻基因组的25．8倍。随机挑选100个克隆进行双末端测序，得到110个序列，经生物信息学分析筛查到67条功能基因序列。选取了14对特异的末端序列作为序列标签位点并设计引物，采用STS-PCR反应池法通过多轮筛选，得到127个阳性克隆，按照相互位置关系，绘制了4个连续的克隆重叠群。该研究为深入了解极大节旋藻分子遗传特性和绘制物理图谱奠定了基础。

精子生成障碍患者Y染色体AZFc区部分缺失分析

目的:探讨人类Y染色体无精子症因子C区(AZFc)部分缺失对男性精子生成的影响。方法:选择Y染色体AZFc区9个序列标签位点(STS)sY1258、sY1291、sY254、sY255、sY1201、sY1206、sY1161、sY1197、sY1191,以ZFX/ZFY(X/Y连锁锌指蛋白基因)和SRY(sY14)基因为内对照。对160例Y染色体微缺失筛查均未发现缺失的无精子症及严重少精子症患者,76例正常生育男性DNA进行多重PCR扩增。疑有DAZ基因缺失的个体,采用基因单核苷酸变异分析(single nucleotide variants,SNV)技术,对DAZ基因4个拷贝中的单核苷酸多态位点进行检测,以确定DAZ基因的拷贝缺失类型。结果:160例无精子症及严重少精子症患者(病例组)gr/gr(sY1291)缺失10例,占6.3%;b2/b3(sY1191)缺失14例,占8.8%;新发现sY1291,sY1197缺失1例,占0.6%;b1/b2缺失1例,占0.6%;b1/b3缺失1例,占0.6%。76例正常生育男性(对照组)检出gr/gr缺失4例,占5.3%;b2/b3缺失4例,占5.3%。gr/gr缺失和b1/b3缺失(对照组和病例组)SNV分析均为DAZ1/DAZ2缺失;b2/b3缺失(对照组和病例组)SNV分析均为DAZ3/DAZ4缺失。1例sY1291,sY1197缺失的DAZ-SNVsY587位点缺失,1例b1/b2缺失者DAZ基因未缺失。结论:b2/b3(sY1191)缺失、gr/gr(sY1291)缺失在我国正常人群中多见,为基因组多态性;b1/b2缺失、b1/b3缺失和sY1291,sY1197缺失可能是导致精子生成障碍的高风险因子。

对无精子症和严重少精子症患者Y染色体畸变和微缺失的研究及评估

目的研究无精子症和少精子症患者染色体畸变及Y染色体(Yq11区)无精子症因子(azoospermicfac-tor,AZF)微缺失情况,建立Y染色体微缺失的临床筛查方法。对原发性无精子及少弱精症患者与AZF微缺失的关系。方法对145例患者(无精子症102例,严重少精子症43例)经染色体核型分析及AZF的3个位点8对引物PCR扩增,检测染色体畸变和Y染色体微缺失率。选取6个Y染色体特异性序列标签位点(STS),用PCR技术检测145例精子发生障碍患者AZF区微缺失情况。结果145例中染色体核型异常12例,占8.3%。AZF区微缺失21例,缺失率为14.5%。无精子症和严重少精子症AZF缺失率分别为14.70%和11.62%。145例中AZF区微缺失21例,表现为无精子症。缺失均在AZFc区,7例为DAZ(sY254、sY255)缺失,另2例为DNA加sY157缺失。结论染色体畸变和Y染色体微缺失是导致无精子症和严重少精子症的主要原因之一。无精子症缺失率高于严重少精子症患者。AZF3个位点8对引物PCR扩增可作为Y染色体微缺失的临床筛查方法。

Y染色体AZFc微缺失规律的研究

目的:探讨中国汉族人群Y染色体AZFc微缺失的规律。方法:采用9个STS位点(sY84、sY86、sY127、sY134、sY152、sY145、sY255、sY254、sY157)的多重PCR,排除sY84、sY86、sY127、sY134缺失的患者,共有194例严重少弱精子症或非梗阻性无精子症汉族男性发生AZFc微缺失;对其中192例sY254、sY255、sY157缺失的患者,再通过sY1191、sY1197、sY1054、sY1125及sY1206 STS位点检测,分析其缺失规律。结果:192例sY254、sY255、sY157缺失患者存在5种缺失模式,其中常见的为sY1197(+)、sY1191(-)、sY1206(-)、sY1054(-)、sY1125(+),占54.17%(104/192);sY1197(+)、sY1191(+)、sY1206(-)、sY1054(-)、sY1125(+),占28.12%(54/192);sY1197(+)、sY1191(-)、sY1206(-)、sY1054(+)、sY1125(+),占14.58%(28/192)。70.83%的AZFc微缺失患者,近端缺失区域发生在sY1197和sY1191之间(属于b2区域);82.29%的AZFc微缺失患者,远端缺失区域发生在sY1054和sY1125之间(属于b4区域)。结论:中国汉族人群AZFc微缺失有5种缺失模式,AZFc微缺失近、远端缺失位点基本集中于复制子b2和b4。

利用SSR标记对新疆部分向日葵自交系材料进行群体结构划分及聚类分析

【目的】序列位置标签(Sequence Tagged Site,STS)为一段短的DNA序列,在其生物染色体上只出现一次,适宜于作为作物基因组的一种地标。【方法】研究随机选取向日葵500对序列标签位点SSR引物,利用其中62对具有多态SSR标记对136份新疆食葵和油葵自交系进行PCR多态扩增和筛选。【结果】62对序列标签位点SSR标记在136份向日葵中扩增表现稳定多态,占所选引物数量的12.4%,扩增产物条带清晰、稳定和易读。136份向日葵群体基因型依据△K的变化,可以分为2大类群。其中73份油葵自交系材料中,70%自交系材料被分配到第1大群,油葵资源材料主要归类在第1大群。30份油葵保持系中只有4份保持系被分配到第2大群,其余保持系均在第1大群。而在43份油葵恢复系中有25份分配到第1大群,其余分配到其它群中,表明油葵恢复系遗传多样性较为丰富。在55份食葵自交系中,仅有21%食葵被分到第1大群,食葵资源材料主要属于第2大群。【结论】食葵的遗传多样性较油葵的遗传多样性丰富,食葵和油葵资源材料间有部分基因相互交叉渗透,为新疆向日葵核心种质的构建和资源的合理利用提供理论支持。

Y染色体及其微缺失与男性不育:过去、现在与将来

由遗传缺陷所引起的精子发生障碍是男性不育的一个重要病因。一直以来,Y染色体被认为缺乏重要的功能基因。直到睾丸决定基因的发现,Y染色体的研究才重新得到重视。Y染色体的成功测序揭开了Y染色体的真实结构和Y染色体微缺失的分子基础。在Y染色体上的220个基因中,位于AZF区的16个编码基因或基因家族与男性生殖与发育相关。至今,在Y染色体AZF区已发现至少12种缺失。Y染色体上大量的同源序列与回文结构所致非等位的同源性重组是Y染色体微缺失发生的分子基础。Y染色体微缺失是已知的导致男性不育的最主要的分子遗传病因,临床上常使用PCR扩增Y染色体特异的序列标记位点来进行检测。基因组学时代的到来为男性不育的研究带来革命性的工具与方法,有利于加深对Y染色体缺失发生机制的了解,进一步明确Y染色体基因的功能以及相互之间的联系,为基因治疗奠定基础。

与小麦赤霉病抗性紧密连锁的基于AFLP片段的STS标记开发(英文)

DNA序列标签位点(STS)是一个操作简便和花费低的分子标记体系,将与某一性状密切连锁的AFLP(扩增片段长度多态性)片段转换成STS标记可直接用于分子育种工作中.本研究利用Ning 7840和Clark的重组自交系及AFLP技术,探测到一个与小麦赤霉病抗性紧密连锁的坐落在染色体3BS的主效数量特性位点(QTL),发现5个PstI-AFLP片段与该QTL显著关联;其中2个片段与赤霉病抗性达到50%左右的表型变异解析度,一个为35个碱基的相引相片段,另一个为222个碱基的相斥相片段.222个碱基的DNA片段被克隆和测序,发现11个克隆中含有5种不同的DNA序列,其中一种序列在5个克隆中完全一致,该序列被用来作为设计STS标记的DNA模板.经多次实验,开发出了一个共显性STS标记.该STS标记与原222个碱基的AFLP片段谱带(banding pattern)完全一致,具有鉴别小麦育种材料赤霉病抗病强弱和加速抗病育种进程的潜力.

肝癌转移抑制基因在8p21.1-23.1染色体上的功能定位

目的:分析人类染色体8p21.1-23.1上肝癌转移抑制基因相关染色体缺失状况,为进一步寻找克隆可能的肝癌转移抑制基因奠定基础.方法:从NCBI的UniSTS数据库查询STS的引物序列,以微细胞杂交克隆DNA为模板(A9/C5F-1和A9/C5F-2为转移不抑制组,A9/C5F-4、A9/C5F-8和A9/C5F-10为转移抑制组)进行STS-PCR扩增.结果:人类染色体8p上D8S552(12786562-12786681),D8S1733(22576582-22576836),D8S1734(22851217-22851336),D8S254(16652480-16652550)及D8S1973(28681110-28681363)等STS位点所在区域在转移抑制组杂交克隆(A9/C5F-4,A9/C5F-8,A9/C5F-10)存在STS位点的不同程度的获得和转移不抑制组杂交克隆组(A9/C5F-1,A9/C5F-2)STS位点的缺失.结论:D8S552-D8S1973所在的人类染色体8p21.1-23.1区域可能存在肝癌转移抑制基因.

簇毛麦6V染色体短臂特异分子标记的开发和应用

为开发簇毛麦6V染色体短臂特异的分子标记,并利用这些标记对缺失系进行鉴定,选用11个RGA和17对STS引物进行多态性分析,其中1个RGA引物和1对STS引物在对普通小麦扬麦5号、簇毛麦及普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系进行多态性分析时,分别检测到一条约1000bp和约800bp的多态性片段,将这两个标记转化为稳定的特异性分子标记,分别命名为CINAU17-1086和CINAU18-723。运用这两对引物对一系列材料进行扩增,只有含6V染色体短臂的材料才能扩增出相应的特异条带,表明这两个标记均位于簇毛麦6VS上。进一步利用簇毛麦6VS缺失添加系、易位系将CINAU17-1086标记定位在簇毛麦6VSFL0.58与FL0.70之间,将CINAU18-723标记定位在簇毛麦6VSFL0.45与着丝粒之间。利用这两个特异标记对通过花粉辐射获得的部分簇毛麦6VS结构变异材料进行PCR鉴定,其结果与细胞学鉴定结果一致。CINAU17-1086和CINAU18-723标记可用来快速检测和追踪导入普通小麦背景中的簇毛麦6VS染色体片段,并对缺失系的断点进行了初步界定。

普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk^(#1)染色体特异分子标记的筛选

为筛选普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体特异分子标记,根据已定位于普通小麦第一部分同源群的EST序列设计104对STS引物,对中国春、鹅观草、黑麦及簇毛麦进行多态性分析。在104对STS引物中,有53对在对照普通小麦中国春与鹅观草、黑麦及簇毛麦之间存在多态性。利用普通小麦-黑麦1R^7R二体异附加系筛选出5对黑麦1R染色体特异标记,分别是CINAU 19-500、CINAU20-950、CINAU21-1500、CINAU22-310和CINAU23-2000;利用普通小麦-簇毛麦1V^7V二体异附加系筛选出5对簇毛麦1V染色体特异标记,分别是CINAU23-1700、CINAU24-1050、CINAU25-1650、CINAU26-500和CINAU27-620;利用鹅观草二体异附加系DA1Rk#1、异代换系DS1Rk#1(1A)、端体系DA1Rk#1L、易位系T1Rk#1S.W、长臂缺失系Del1Rk#1L筛选出5对鹅观草1Rk#1特异标记,分别是CINAU27-960、CINAU28-1360、CINAU29-480、CINAU30-560和CINAU31-520。研究表明,可以利用普通小麦的EST序列设计PCR引物,转化成STS标记,筛选普通小麦近缘物种黑麦、簇毛麦及鹅观草等染色体特异的分子标记,快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体或染色体片段,为深入研究普通小麦远缘杂种材料提供新的工具。

簇毛麦1V染色体臂的EST-STS标记的开发与应用

为了给小麦远缘亲本的研究和利用提供参考,根据已定位于普通小麦1DS和1BL上的EST序列设计96对STS引物,对中国春、簇毛麦、中国春-簇毛麦的1V附加系和易位系进行多态性分析,开发出4个簇毛麦1V染色体臂的STS标记。其中,BE499250-STS和BE591682-STS/RsaⅠ为共显性标记,可以扩增出1条1VS片段,同时还可以扩增出1条1DS片断,能将1DS和1AS、1BS区分开来;BE581358-STS/HaeⅢ和BE585781-STS/RsaⅠ是显性标记,能分别扩增出2条和1条1VL片段,但扩增的小麦染色体片段不能区分1DL和1A、1B。这些标记已成功地应用于小麦-簇毛麦整臂互补易位系T1DL.1V#3S和T1DSo1V.3L的筛选。

Y染色体AZFa区域sY84位点基因多态性分析

Y染色体微缺失是男性精子发生障碍最常见的原因之一,实验室多采用多重PCR法检测Y染色体无精子因子（azoospermia factor,AZF）区域15个Y染色体特异性序列标签位点（Y-specific sequence-tagged site,sY STS）的微缺失[1],但AZF区域存在的基因多态性对常规检测是否存在影响尚需进一步验证.本实验室发现1例因引物结合位点多态性而导致的AZFa区域sY84假性缺失结果.