无精子症患者Y染色体序列标签位点-聚合酶链反应与二代测序检测的比较

目的观察无精子症患者Y染色体序列标签位点-聚合酶链反应(STS-PCR)与二代测序(NGS)检测的差异。方法对133例无精子症患者,采用STS-PCR检测Y染色体AZF微缺失的15个STS位点,包括AZF a区的sY84/sY86、AZF b区的sY124/sY127/sY128/sY133/sY134/sY143/sY1192、AZF c区的sY152/sY239/sY242/sY254/sY255、AZF b/c区的sY145,同时采用NGS检测Y染色体基因组拷贝数变异(CNVs),并统计分析两种检测方法的差异。结果133例无精子症患者中,Y染色体AZF微缺失异常17例(12.78%),其中缺失14个STS 1例,占5.88%;缺失12个STS 3例,占17.65%;缺失11个STS 1例,占5.88%;缺失6个STS 1例,占5.88%;缺失5个STS 1例,占5.88%;缺失4个STS 2例,占11.76%;缺失2个STS 1例,占5.88%;缺失1个STS 7例,占41.18%。Y染色体CNVs异常12例(9.02%),其中既重复又缺失3例,占25%;重复(dup)4例,占33.33%;缺失(del)5例,占41.67%。Y染色体AZF(15个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比,差异有统计学意义(P<0.05),而Y染色体AZF(经典6个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比,差异无统计学意义(P=0.357)。结论STS-PCR和NGS互有补充,前者不能检测出重复,后者可能漏检小片段缺失。在无精子症遗传因素的实验室检查中,可以考虑采用NGS作为筛选,而采用STS-PCR作为验证。

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端延伸快速分离全长cDNA序列

建立一种cDNA文库基础上运用热启动聚合酶链反应末端快速扩增分离人类新基因全长cDNA序列的新技术。以文库载体序列与待扩增目的基因片段为模板各设计引物进行热启动聚合酶链反应扩增 ,从人胎肝cD NA文库中获得氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化过程中差异表达序列标签片段 (FRG4 )的全长cDNA序列 ,聚合酶链反应产物克隆到pGEM T载体中 ,并测序鉴定 ,从而成功获得FRG4的全长cDNA序列。

应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌进行同源性分析

目的了解临床不同来源的鲍曼不动杆菌是否存在同源性,判断其是否存在耐药菌株的克隆播散,追踪其在医院交叉感染的可能途径,以便有效防控鲍曼不动杆菌在医院中传播。方法收集2012年10月至2013年6月临床分离的73株多重耐药鲍曼不动杆菌,用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)对菌株进行同源性分析。结果 73株多重耐药鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR分型分为8个基因型,分别用A、B、C、D、E、F、G、H表示,其中A型31株,B型15株,C型12株,D型8株,E型3株,F型2株,G和H型各为1株。A型为主要的流行株,分布在多个不同的科室。重症监护室(intensive care unit,ICU)分离的菌株存在6个基因型;骨科系统病区存在4个基因型;急诊科有5个基因型;内科发现有6个基因型;外科发现3个基因型。ICU病房环境物体表面共分离出4株鲍曼不动杆菌,其中9号和10号菌株来自于不同患者的床旁,12号和13号来自于护理站电脑键盘。结论临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌存在多个基因型。多重耐药鲍曼不动杆菌存在时间和空间的聚集性。

石蜡包埋组织中目的基因原位逆转录-聚合酶链反应检测

目的探讨原位逆转录 -聚合酶链反应技术 (ISRT -PCR)在普通制作石蜡包埋组织中的应用及价值。方法应用直接法ISRT -PCR方法对普通制作、石蜡包埋淋巴瘤组织中的丙型肝炎病毒 (HCV)基因组序列进行检测。结果从存档多年的福尔马林固定、普通制作石蜡包埋淋巴瘤组织中检测到HCVRNA序列。结论ISRT -PCR可用于福尔马林固定。

创造酶切位点PCR-RFLP检测PON2(rs12026)基因多态性

目的:建立简便易用的PON2基因单核苷酸多态(rs12026)的检测方法。方法:应用创造酶切位点原理设计引物,通过PCR-RFLP技术判断PON2基因SNP位点多态性。结果:设计一对特异引物并PCR扩增含PON2多态位点的DNA片段,根据限制性内切酶BsmAI酶切结果判断PON2位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论:应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的PON2多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

粘质沙雷菌中SHV型β-内酰胺酶编码基因的克隆及序列分析

目的研究重庆地区临床分离的粘质沙雷菌E 121编码超广谱β-内酰胺酶(ESBL s)的基因。方法PCR扩增ESBL s编码基因片段,克隆入pUCm-T载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列并确定亚型,等电聚焦测定β-内酰胺酶的等电点(pI)。结果PCR扩增结果显示粘质沙雷菌E 121产生的ESBL s为SHV型,其基因片段含756个核苷酸,G enB ank查询其核苷酸序列与SHV-28型ESBL s完全相同。该耐药株至少含有等电点pI约为5.4和8.2的两种β-内酰胺酶。结论重庆地区粘质沙雷菌E 121所产ESBL s亚型为SHV-28。

创造酶切位点与PCR-RFLP原理在基因多态检测中的应用探讨

目的:探讨创造酶切位点与PCR-RFLP原理在基因多态检测中的应用及其注意事项。方法:应用创造酶切位点原理设计引物,通过PCR-RFLP技术判断多个基因多态性。结果:共对MGMT、ADH2、MTH-FR和PON2基因多种多态位点进行了实验研究,均成功完成检测。结论:应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的检测方法具备简便、经济、快速的特点,适宜推广应用。

人血红蛋白β-链基因AvaⅡ位点扩增片断长度多态性

目的：为了研究日本人群β-链基因AvaⅡ酶切位点的遗传多态性以及该位点等位基因频率的分布。方法：采用PCR- RFLP技术,对35例无血缘关系的健康日本大学生的70条染色体进行检测,然后用X^2检验进行统计学处理。结果：等位基因B_1频率为0．4715,等位基因B_2频率为0．5287,杂合度H=0．5429,期望杂合度h=0．4986,多态信息量PIC=0．7635；B_1、B_2的传递规律和理论上预计的完全符合,认为日本人群β-链基因AvaⅡ酶切位点也具有遗传多态性,表明β-链基因AvaⅡ酶切位点具有适合信息,并且与国外报道的无显著性差异。结论：这对遗传制图、基因分离、疾病的关联研究,法医学个体识别和双生子的卵性鉴定有一定的价值。

1999～2003年鲍氏不动杆菌耐药变迁与β-内酰胺酶表型及基因型检测

目的了解5年来鲍氏不动杆菌的耐药性变迁、产β内酰胺酶(BLA)及BLA基因型存在状况。方法采用微量稀释法测定在1999年1月～2003年12月间,自临床分离的549株鲍氏不动杆菌对23种抗菌药物的敏感性、三维试验法检测超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、AmpC酶、聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析BLA基因型。结果5年中总敏感率居前4位的依次是亚胺培南(96.4%)、多黏菌素E(93.0%)、美罗培南(92.9%)和哌拉西林/他唑巴坦(30.1%),其余在0.0～20.9%之间;5年间亚胺培南的抗菌活性最高,且历年不减,敏感率>95.0%;其次是多黏菌素E和美罗培南,敏感率分别>88.0%和84.0%;5年间耐药率上升最快的是阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢噻肟、哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦;ESBLs及AmpC酶单独阳性率分别为30.0%和1.7%,48.3%菌株同时产ESBLs和AmpC两种酶;BLA基因TEM和SHV阳性率分别为100.0%和29.2%,基因型分别为TEM1、SHV12、SHV48和SHV56;OXA、CTXM、PER和VEB基因均阴性。结论近5年间鲍氏不动杆菌对大多数常用广谱抗生素的耐药性在逐年增强,并且多重耐药、产ESBLs及AmpC酶状况相当严重,BLA基因TEM和SHV携带率高;亚胺培南仍是抗多重耐药鲍氏不动杆菌感染最有效的抗生素。

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株TEM型耐药基因分布

目的 了解 1999～ 2 0 0 0年合肥市多所医院临床分离的产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中 ,TEM型 β 内酰胺酶基因型分布。方法 酶抑制剂增强的肉汤稀释法筛选出产ESBLs细菌 ,PCR扩增其TEM型 β 内酰胺酶编码基因片段 ,克隆入pGEM Teasy载体 ,双脱氧链终止法测定核苷酸序列并确定TEM基因型。结果 98株产ESBLs菌株中有 79株产TEM型 β 内酰胺酶 ,其中TEM 1型 75株和TEM 10型 4株。结论 合肥市产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中存在 2种TEM型 β 内酰胺酶 ,在国内首次报道一种新的 β 内酰胺酶(TEM 10 )。

一种新基因型TEM-128β-内酰胺酶的发现及其临床意义

目的 分析产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)鲍曼不动杆菌TEM型β-内酰胺酶(BLA)的编码基因并确定其亚型。方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增BLA编码基因TEM、SHV、OXA、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9、PER和VEB片段,双脱氧链终止法测定核苷酸序列、确定亚型。结果 临床分离的鲍曼不动杆茵HZ38株产生TEM型BLA,其扩增片段含1 049个核苷酸,核苷酸及相应的氨基酸序列经Gen-Bank查询无相同序列,为新发现的一种BLA TEM-128型(GenBank注册号:AY359287)。结论 临床分离的鲍曼不动杆菌HZ38株所产BLA为TEM-128亚型,为一种新发现的新型BLA。

靶序列富集多重PCR-液相芯片联合检测4种常见呼吸道病毒的初步应用

目的呼吸道病毒是引起婴幼儿呼吸道感染的最主要病原体,为快速准确诊断其感染,文中建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法采集南京总医院儿科就诊的有急性呼吸道感染症状的患儿咽拭子标本120例及30例正常对照标本,分别纳入患儿组和对照组。针对A型流感病毒(Flu A)、B型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)和B型(RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和Luminex液相芯片(x MAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了特异性、灵敏度评价。收集以急性上呼吸道感染为主要表现的患儿咽拭子标本,用上述建立的方法进行检测分析,分别与单病毒基因荧光定量PCR检测方法及x TAG液相芯片法进行比对检测。结果建立了Flu A、Flu B、RSVA和RSVB4种呼吸道病毒的特异性快速分子检测方法且灵敏度可达10拷贝/μL。用快速分子检测方法和单病毒基因荧光定量PCR法对120例疑似患儿咽拭子标本进行检测,快速法阳性检出率为31.7%(38/120),荧光定量法阳性检出率为29.2%(35/120)。经一致性检验分析提示2种方法一致性较强(k>0.7)。部分标本同时采用x TAG液相芯片试剂盒进行检测,经一致性检验分析提示2种方法一致性较好(k>0.6)。结论临床的初步应用证实了4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法具备灵敏、特异、快速等优点,为临床早期、准确判断呼吸道感染的病原体提供实验依据。

铜绿假单胞菌耐药基因分析及多位点序列遗传分型

目的了解2011-2012年深圳市南山区医院病人,各医院、诊所内环境台面涂抹样、医护人员手涂抹样分离的铜绿假单胞菌,抗生素耐药基因分布及基因的遗传多样性。方法采用聚合酶链反应技术检测铜绿假单胞菌的20种耐药基因:TEM、VEB、CARB、OXA、SHV、PER、GES、GTX、SPM、GIM、IMP、VIM、DHA、oprD、Aac(6′)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅱ、Aac(3′)-Ⅰ、Aac(2″)-Ⅰ、qacE1-sull及Ⅰ类整合子基因。采用多位点序列分子分型方法进行聚类和克隆分析。结果检出11种耐药基因:TEM、SHV、IMP、DHA、Aac(6’)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅱ、Aac(3′)-Ⅰ、Aac(2″)-Ⅰ、qacE1-sull、Ⅰ类整合子及oprD基因,检出率分别为8.1%、6.4%、4.8%、9.7%、4.8%、14.5%、4.8%、56.5%,8.1%,8.1%,oprD基因缺失率为61.2%。52株铜绿假单胞菌检出耐药基因,形成19种耐药基因谱。多位点序列分型方法将62株铜绿假单胞菌,分为39个ST型,5个克隆群,1个优势克隆群CC244,1个优势独特型ST856。结论不同类型样本分离菌株携带耐药基因存在差异,部分病人分离株携带多种耐药基因。本研究铜绿假单胞菌具有遗传多样性,存在优势克隆群。

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株的SHV型耐药基因分布和耐药性分析

目的了解1999～2000年合肥市临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,SHV型β-内酰胺酶基因型分布情况和耐药性分析。方法标本为安徽省细菌耐药性监控中心所留取的1999年9月～2000年9月从合肥市4家大医院临床分离的、已被证实产ESBLs的98株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,采用聚合酶链反应(PCR)扩增产SHV型β-内酰胺酶菌株基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列以鉴定基因型。按照2005年CLSI推荐标准,用琼脂稀释法分别测定临床分离菌株和转移结合子对11种不同抗菌药物的MIC值,并比较分析两者的不同结果。结果98株产ESBLs菌株中有29株产SHV型β-内酰胺酶,其中SHV-1型8株,SHV-11型5株,SHV-12型11株,SHV-18型1株,SHV-28型1株,SHV-89型3株[序列号为(DQ193536)]。临床分离株的MIC结果显示对哌拉西林,头孢噻肟,头孢曲松的敏感率低;转移结合子的敏感性较临床分离菌株有所上升。结论合肥市部分医院产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌检出率较高,我们在国内外首次报道了SHV-89;并且本地区产SHV型β-内酰胺酶菌株的耐药性较高。

抗生素性腹泻肠道杆菌产超广谱β-内酰胺酶基因型的调查

目的:研究抗菌药物使用后,引起腹泻患者肠道杆菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌的耐药基因型并进行序列分析.方法:收集临床住院应用抗菌药物后出现腹泻患者的大便或肛拭子进行培养,分离产ESBLs的肺炎克雷伯菌50株、大肠埃希菌21株和变形杆菌18株,通过改良Hodge实验、EDTA双纸片增效试验、分别测定KPC、金属酶;聚合酶链反应(PCR)检测其耐药基因、分析PCR产物序列并在GenBank中比对分析,总结产ESBLs细菌同源性的和变异情况.结果:89株产ESBL的菌株中,有64株携带CTX型耐药基因,68株携带TEM型耐药基因,21株携带SHV型耐药基因.肺炎克雷伯菌中CTX型占到84%(42/50),TEM型占到76%(38/50),SHV型占到15%(7/50);变形杆菌中没有SHV型,而TEM型占到100%(18/18),CTX型占到40%(7/18);大肠埃希菌中CTX占到100%(21/21),SHV型和TEM型均为83%(17/21);同时检出3株产KPC和22株产金属酶的细菌.结论:本院抗生素腹泻患者肠道杆菌产ESBLs耐药基因主要以CTX和TEM为主,同时携带两个或两个以上耐药基因的细菌占49%(44/89).

重复序列PCR与多位点分型技术在白假丝酵母菌基因分型中的比较

目的应用多位点序列分型技术(MLST)和重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)对临床分离出的白假丝酵母菌进行分型,并对两种方法作出应用评价。方法收集上海地区医院中真菌性阴道炎分离出的40株白假丝酵母菌,选择合适引物进行扩增,通过电泳比较分析获得REP-PCR分型。选择7对管家基因进行PCR反应并测序,将测序结果与标准序列进行比对,获得由7对管家基因组成的等位基因谱,最终得到相应的序列分型。结果 REP-PCR中Ca22-Ca22引物对得到电泳条带最优,40株白假丝酵母菌共分成7种REP-PCR型;MLST分型得出29种,且均为新型。结论 MLST分辨率较REP-PCR高,但由于REP-PCR分型方法更为快捷、经济,更适用于实验室大量菌株分型和临床分型。MLST则更客观,更适合用于进化学的研究及全球性流行病学的调查研究。

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2AcDNA的克隆及序列分析

目的 :克隆爱泼斯坦 巴尔病毒 (EBV)潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)基因 ,进一步研究其基因工程疫苗。方法 :用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增出EBVB95 8株LMP2A全部编码蛋白的基因 ,并克隆至载体pGEM T中 ,通过α 插入失活、PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒 ;采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸序列。结果 :克隆出LMP2A第 1个外显子到第 8个外显子的全部编码蛋白的cDNA ,测序结果与EB病毒B95 8原型株LMP2AcDNA作同源比较 ,完全一致。结论 :本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。

人β-防御素-3基因的克隆和序列测定

目的 克隆人β-防御素 - 3的基因 .方法 提取人皮肤组织的总 RNA,反转录为 c DNA作为模板 ,采用 PCR的方法克隆人β-防御素 - 3基因 . PCR产物连接入 p GEM- T- EASY载体 ,转化 DH- 5α感受态细胞 ,蓝白筛选 ,对酶切及 PCR鉴定含有目的片段的克隆进行测序 .结果 获得预期大小的 PCR产物 ,经序列鉴定证实为人β-防御素 - 3基因 .结论 获得了人β-防御素 -