表达序列标记(EST)研究进展

表达序列标记 (EST)是通过对cDNA文库克隆进行大规模测序所获得的 5′或 3′端序列 ,长度一般为 30 0～ 5 0 0bp ,可代表生物体某一时间内某组织中表达的基因 .本文就EST技术原理、概念最新发展及其在大规模快速克隆基因。

恶性疟原虫FCC1/HN株新抗原表达序列标记位(ESTs)的获得

目的： 以筛选恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ 株λｇｔ１１ ｃＤＮＡ 表达文库所获得的强阳性克隆作基础， 对上述强阳性克隆的ｃＤＮＡ 插入片段进行ＤＮＡ 序列测定， 阐明相对应的新表达序列标签 （ＥＳＴｓ）， 作为发现新抗原基因的线索。方法：以ｃＤＮＡ 表达文库接头的较长链作ＰＣＲ引物、扩增ｃＤＮＡ 插入片段，将扩增产物克隆入Ｍ１３ ｍ ｐ１８测序载体， 进行部分ＤＮＡ 序列测定、编辑， 将之在ＧｅｎＢａｎｋ 中进行ＤＮＡ 序列同源性搜索比较和分析。结果： 获得１ 个Ｃ０３ 序列为已知恶性疟原虫热休克蛋白７０－２ 基因片段， 发现５ 个新的具有抗原意义的恶性疟原虫表达序列标记位 （ＥＳＴｓ）。结论： 这５ 个新的恶性疟原虫表达序列标记位为发现新的恶性疟原虫抗原基因奠定了基础。

染色体6q16.3区域一个与儿童急性淋巴细胞白血病相关表达序列标记的鉴定

目的 寻找染色体6q16. 3区域与儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)相关的表达序列标记(EST),为筛选儿童ALL候选基因打下基础。方法 运用生物信息学同源性比较筛选EST的策略,结合逆转录PCR方法,检测6q16. 3区域的相关EST在儿童ALL淋巴细胞和正常淋巴细胞中的表达。结果 在6q16. 3区域筛选到一个在儿童ALL细胞中低表达的ESTAA403058,与正常淋巴细胞相比较,在10例儿童ALL淋巴细胞中的7例其表达下调(P<0. 001)。结论 染色体6q16. 3区域ESTAA403058在儿童ALL中表达下调,提示其可能参与儿童ALL癌变过程,为克隆儿童ALL相关基因提供了新线索。

长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)表达序列标记分析

分别采用BlastX和Blast2go软件对453条非冗余的长心卡帕藻EST序列进行匹配分析和GO注释。结果表明,有281条序列与蛋白数据库中序列匹配,有132条序列被归属为3个子本体:分子功能、生物学过程和细胞组成。同时筛选到24个与逆境适应相关的基因,包括应对胁迫反应和抗氧化反应的基因。采用GCUA软件,进行长心卡帕藻基因密码子偏倚性的研究。结果表明其密码子偏倚性与其它红藻差别较大,平均G+C含量和密码子的第三位的G+C含量均较其它藻类偏低。上述工作为进一步研究长心卡帕藻基因及其功能奠定了基础。

DNA序列标记在坛紫菜种质鉴定中适用性的比较分析

坛紫菜(Pyropia haitanensis)是我国南方沿海的主要海水养殖品种之一,准确的种质鉴定是避免种质混淆和实现其良种化栽培的基础.为筛选出适合于坛紫菜品系间种质鉴定的序列标记,本实验参考动物和植物条形码的构建方法,以11个坛紫菜种质品系为材料,对4种常用于种质鉴定的序列标记(Cox1、Cox2-3、UPA和ITS-5.8S)通过序列同源性分析和构建基于遗传距离的系统进化树两种方法进行比较分析和评价,结果发现:通过序列同源性分析,只有ITS-5.8S序列标记能将11个品系完全分开,而其他3个标记均存在多个品系序列同源性为100%,无法区分的问题;而通过基于遗传距离的系统进化树分析也表明Cox1、Cox2-3和UPA序列标记无法将11个坛紫菜品系完全区分开,而ITS-5.8S序列标记除了8-Ⅰ和9-Ⅳ外,对其他品系均可以很好地区分.由此认为ITS-5.8S是适用于坛紫菜品系间种质鉴定的理想分子标记.

碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量

建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称"SRPP")。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。

基于素数序列标记法的XML查询处理算法

XML索引为查询处理提供了高效的帮助,其中F&B索引是已知的处理分枝查询的最小的索引,但快速创建F&B索引和利用F&B索引完成查询处理的算法却很少有人研究.本文提出了一种素数序列标记法,这种标记法不仅有助于快速的建立F&B索引,更可以高效的完成F&B索引上的查询处理.此外,我们还给出了基于素数序列标记法的查询处理算法,即素数整除匹配算法,该算法可以高效的判定某节点是否有某分枝子结构.实验表明基于素数序列标记法的F&B索引创建方法比SAM算法快,在多个数据集F&B索引上素数整除匹配算法优于关联路径连接算法和Tw igStack算法.

大蒜转录组简单重复序列标记分析与分子标记开发

为探明大蒜转录组简单重复序列标记(SSR)的特征,开发适合大蒜育种的SSR引物,利用MISA软件对大蒜转录组序列进行SSR位点检测与信息分析,并通过PCR扩增检测引物的有效性和多态性。结果表明:大蒜转录组测序获得444865条unigenes,共鉴定出141132个SSR位点,出现频率为31.72%,平均每3.45 kb出现1个SSR位点。单核苷酸和二核苷酸为SSR位点中优势类型,分别占总SSR的68.02%和24.12%;SSR位点共有82种重复基序,以A/T和AT/AT数量较多,占总SSR位点的65.02%和12.37%。利用Primer 3.0共设计出125616对SSR引物,在随机选取的14对引物中有12对引物能够有效扩增,其中6对引物在35份大蒜资源中表现出多态性,扩增共得到26条多态性条带,每对引物平均产生4.33条条带。UPGMA分析显示,在遗传相似系数0.7569处,35份大蒜资源可被分成5大类群。综上所述,利用大蒜转录组数据进行SSR分子标记开发能够获得较高频率的SSR位点,且开发的SSR标记可用性强。

栽培花生中基因表达序列标记的产生和标记开发

本试验用抗叶片斑点病和番茄斑枯病毒的花生品系C34—24的叶片以及耐干旱胁迫和收获前黄曲霉素污染的花生品系A13的未成熟荚果制备成mRNA，然后用其mRNA构成两种cDNA文库，最后用这两种cDNA文库来开发出了栽培花生（Arachishy pogaea L．）中的表达序列标记（Expressed Sequcncetag，Esr）文库。对随机选择的cDNA克隆进行部分地排序，以便产生总共1825个ESTs，

小麦条锈病抗性基因Yr5的序列标记位点和酶切扩增多态序列标记的构建

Yr5基因赋予了到目前为止美国所鉴定出的所有小麦条锈病病原小种的抗性。Yr5基因的共分离抗性基因类似多态(RGAP)标记是可以获得的，但是这些标记的应用需要有关聚丙烯酰胺凝胶电脉以及不同品种间可能不是多态性的条件。

六倍体小麦部分同源组1中表达序列标记的染色体箱图以及与水稻和拟南芥属间的部分同源性

总共944表达序列标记(ESTs)形成了2212个EST位点；这些位点被绘制在六倍体小麦(Triticum aestivum L.)的部分同源组1染色体上。为了表示EST分布情况，构成了EST缺失图和组1染色体的共有序列图。EST位点在染色体1A、1B和1D中表现为不规则分布，分别分布有660、826和726个EST。对全部3个染色体而言，其长臂上的EST位点数比短臂上的多一些。EST在染色体臂上的分布不是随机的，EST群出现在短臂的末端区域和长臂的中间区域。

对水稻褐飞虱抗性相关的数量性状位点和表达序列标记的制图

为了绘制负责水稻褐飞虱抗性的基因，我们用褐飞虱抗性品系与敏感性品种Ninghui63杂交，育成—个重组自交系群体，以该群体为基础绘成了一个水稻遗传图。检测到了褐飞虱抗性的4个数量性状位点。采用有限的相减混杂法分离出了由褐飞虱进食所调节的表达序列标记(EST)，并且通过RFLP制图和收索水稻基因组数据库，把这些标记限定在了几个染色体上。EST标记的分布表现为几组，有些EST标记与已知QTL和已知抗性基因有关系。这些发现说明，绘制不同的EST标记可能是鉴定植物后备保卫基因的一种有用方法；而其保卫基因对培育褐飞虱抗性品种是有益的。

川芎SSR标记开发及遗传多样性分析

目的:基于川芎基因组调研结果开发简单重复序列(SSR)标记,对109份川芎种质资源进行遗传多样性分析,为川芎种质资源评价、保存和新品种选育等提供理论依据。方法:基于Survey测序已组装序列挖掘川芎基因组中的SSR位点并设计引物,筛选多态性高的引物,对109份川芎种质资源进行遗传多样性和遗传分化分析,并在川芎及其近缘物种中进行通用性验证。结果:36对引物在109份川芎种质资源中共检测到102个等位基因位点,观测等位基因数为2.8333,期望杂合度为0.4885,Shannon's指数为0.8071,Nei基因多样性为0.4860,多态信息含量为0.4194,采集的109份川芎种质资源具有丰富的遗传多样性。基于遗传距离的聚类分析显示,在遗传相似系数为0.76处,109份川芎聚为两大类,但其与地理分布关系不大。通用性验证显示,36对SSR引物在川芎及其近缘物种中通用性较好。结论:开发的36对SSR标记能很好地揭示川芎的遗传多样性,供试109份川芎种质遗传分化小、基因流较大。

基于表型性状及SSR标记的天麻种质资源遗传多样性分析

目的:研究天麻的遗传多样性,分析杂交、自交天麻种质资源间的差异。方法:以26个天麻种质资源为材料,基于形态学标记对各种质的株高、蒴果数、花序长度、蒴果长度、蒴果宽度、块茎长度、块茎宽度、单重、有效成分含量等表型性状进行方差分析、聚类分析及相关性分析;结合SSR分子标记进行遗传多样性研究,并构建SSR指纹图谱。结果:天麻表型性状中,各性状的变幅不同,变幅较大的为蒴果重、单重、块茎长、鲜品产量、干品产量、天麻素含量、对羟基苯甲醇含量;变幅较小的为蒴果宽、茎秆粗、肚脐眼直径、横纹环数、折干率。相关性分析结果显示,部分性状间相关性显著;表型性状聚类结果显示,在阈值为11.32时,将天麻资源分为2大类群。从合成的7对引物中筛选出3对SSR特异性引物,PCR扩增获得较清晰的SSR指纹图谱。UPGMA聚类可明显区分天麻自交系及杂交系,与表型聚类分析结果较为一致。结论:利用形态学标记及SSR分子标记相结合的方法可有效区分天麻杂交组合及自交组合。

水芹SSR分子标记开发与遗传多样性分析

水芹是伞形科水芹属多年生草本植物,是一种重要的药食两用蔬菜作物。在中国,水芹的种植区域十分广泛,然而目前对其种质资源的鉴定、培育及遗传信息的研究较少。本研究利用溧阳白芹基因组开发水芹简单重复序列(SSR)分子标记,分析55份水芹的遗传多样性并用非加权组平均法(UPGMA)构建系统进化树,同时用SSR扩增条带数据构建DNA指纹图谱。结果显示,共鉴定到325699个SSR位点,其中单核苷酸SSR重复单元、二核苷酸SSR重复单元、三核苷酸SSR重复单元、四核苷酸SSR重复单元、五核苷酸SSR重复单元、六核苷酸SSR重复单元的出现频率分别为33.94%、54.62%、9.31%、1.66%、0.17%、0.29%,其中二核苷酸SSR重复单元数最多,有177887个,且A/T(占比为29.98%)和AT/AT(占比为35.70%)是较丰富的重复类型。UPGMA分析结果表明,33对高多态性引物[多态信息含量(PIC)>0.25]可将55份水芹材料分为4组。利用筛选出的4对引物(Oj-084、Oj-110、Oj-112、Oj-156)可以将55份水芹材料完全区分开,并且可构建指纹图谱。研究结果可为水芹种质资源鉴定、保护及分子遗传育种提供有力依据。

通过改良RAPD技术获得黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃的3条SCAR新标记

目的寻找快速区分黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃的序列特征扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)新标记。方法在改良的随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)的基础上对10个物种进行基因组DNA随机扩增、分子克隆和测序,分别设计了可鉴别3个物种的SCAR标记。结果成功筛选出3个SCAR标记,其相应的特异性标记分别为N2-12、A2-17和A6-33;其中SCAR标记N2-12在黑毛种属中扩增出约750 bp的特异性条带,SCAR标记A2-17在蜂腰石斛中扩增出约750 bp的特异性条带,SCAR标记A6-33在石仙桃种属中扩增出约600 bp的特异性条带。结论N2-12、A2-17和A6-33这3对特异性SCAR新标记能快速、准确的区分出黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃这3个物种,为今后进行该中药道地药材样品的鉴定提供了实验依据。

基于水稻内含子长度多态性开发禾本科扩增共有序列遗传标记

通过在多态位点两侧的保守编码序列上设计引物,可以开发出在不同物种间通用的基于PCR的分子标记,称为扩增共有序列遗传标记(ACGM)。【目的】探讨利用已公布的水稻籼、粳两亚种的基因组序列开发禾本科ACGM的可行性。【方法】根据水稻两亚种间的内含子长度多态性,开发了38对ACGM引物。用这些引物对玉米、粟、大麦、小麦、竹子、旱稗草和大米草6个属共12个不同材料进行PCR实验。【结果】几乎所有引物都可在至少1种材料中扩增出特异条带,而1/3以上的引物可以在全部供试材料中获得特异扩增产物。在每一种供试材料中,平均大约有2/3的引物可以成功扩增出目的条带。这些引物在各属内不同种、亚种或品种(系)之间的多态性比例在24.1%～90.3%之间,平均为44.6%。【结论】利用水稻基因组序列信息开发禾本科通用型ACGM是可行的。

基于SSR标记构建叶子花品种的分子身份证

以219个叶子花栽培品种为研究对象,在140对引物中筛选出20对多态性高的简单重复序列(SSR)荧光标记引物对219个品种进行扩增,共扩增出414条带型,平均每对引物扩增出20.7条;20对引物的多态性信息含量(PIC)为0.189~0.823,平均值为0.696,当PIC>0.50时可以认为该引物为高度多态性信息引物;20对引物在219个品种中共检测出219个等位基因,平均每对引物检测出10.95个;20对引物在219个品种组成的群体中,其平均有效等位基因数为4.212个,平均Shannon多样性指数为1.633,平均观测杂合度为0.430。在构建叶子花品种分子身份证方面,通过SSR标记技术,根据PIC的高低选择引物组合,采用数字与英文大小写字母相结合的方法,对不同长度的扩增片段进行赋值,最终用20对引物构建了219个叶子花品种的分子身份证,并通过在线软件进一步转换成唯一可识别的品种信息二维码。叶子花品种分子身份证和信息二维码的构建,可避免出现由于品种繁多及命名混乱而导致的同名异物和同物异名的现象,促进品种知识产权保护,做到种质可追溯。