鸡的J亚群白血病病毒的分离及部分序列比较

通过接种鸡胚成纤维细胞、聚合酶链式反应 (PCR)技术及特异性单抗的间接荧光抗体反应 (IFA) ,从某大型肉用型种鸡场的疑似J亚群白血病的病鸡中 ,以及 2 5个临床健康的商品代肉鸡群的 2群中 ,分离鉴定出J亚群禽白血病病毒 (ALV J)。在用抗ALV Jgp85单克隆抗体JE9的IFA中 ,来自病鸡群的两株病毒SD990 1和SD990 2呈强阳性反应 ,来自临床健康肉鸡群的YZ990 1和YZ990 2株呈弱阳性反应。对YZ990 1株和SD990 2株的PCR产物直接测序结果表明 ,这二个中国株的囊膜蛋白 gp85的氨基酸组成与原型株HPRS 10 3及美国分离株ADOL Hcl有 89%～ 93%的同源性 ,它们相互间的同源性是 92 %。其 3′端LTR区与原型株HPRS 10 3则有 95 %～ 97%的同源性 ,但中国的两株病毒在紧靠 3′端LTR的“E”成分中 ,出现了一个 139个碱基的缺失性突变 ,而代之以一个 11个碱基的插入序列。

笛鲷属(Lutjanus)鱼类线粒体16S rRNA基因序列比较及系统学分析

对笛鲷属9种鱼的线粒体DNA16S rRNA基因片段进行了PCR扩增,扩增产物经纯化后测序,得到了长度为561bp的分析序列。结合GenBank中的另外9种笛鲷的16S rRNA同源序列计算得出A、T、G、C的含量平均为28.5%、22.1%、23.6%和25.8%,AT含量稍高于GC含量,18种笛鲷碱基组成差异不大。利用MEGA3.1软件对所得序列进行比对后检测到72个变异位点,其中包括简约信息位点44个,在变异位点中75.61%的碱基替换是由于发生了转换,转换/颠换平均为3.1︰1。计算了种间的遗传距离,结果表明,序列差异在0.0193-0.0680之间,其中勒氏笛鲷和金焰笛鲷、勒氏笛鲷和金带笛鲷的序列差异最小,而红鳍笛鲷和金焰笛鲷、红鳍笛鲷和画眉笛鲷的序列差异最大。选用高体四长棘鲷(Argyrops spinifer)为外群,利用NJ法构建了分子系统树,结果表明:本研究中的9种南海笛鲷与其它9种笛鲷进化关系较远;并且南海9种笛鲷相互之间仍然保持着着相对较远的遗传距离,遗传多样性较好。

企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列。cDNA全长2 308 bp,3’非编码区域(UTR)为234 bp,5’UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EE-VD。结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列。与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失。两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个。系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起。该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义。

苦荞和甜荞查尔酮合成酶基因的克隆及序列比较

以苦荞品种‘西农9920’和甜荞品种‘西农9976’为材料,根据其它植物查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因DNA序列的保守区域设计的一对简并引物,进行PCR扩增,从2种荞麦基因组中克隆出了长度均为860 bp的CHS基因片段,对其进行回收、克隆,挑选阳性克隆测序;序列分析表明这2个片段含有CHS基因的N端和C端的结构域,分别为苦荞和甜荞的CHS基因片段,命名为FtCHS和FeCHS。对获得的2种荞麦CHS基因的DNA序列进行比较分析,发现两者间存在多达43处单碱基多态性,这些单碱基多态性可能是苦荞和甜荞种子中类黄酮含量差异的重要原因之一。苦荞和甜荞CHS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的掌叶大黄和石竹科的满天星的同源性较近。

4种胡蜂前溶血肽原基因的克隆与序列比较

从雌性亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂毒腺中抽提总RNA ,通过RT PCR方法扩增得到 4种胡蜂蜂毒前溶血肽原的cDNA ,再将扩增产物克隆到pGEM Teasyvector上。测序结果表明 :扩增得到的片段长度均为2 13bp ,系蜂毒前溶血肽原编码区的cDNA。经序列比较 ,4种胡蜂蜂毒前溶血肽原之间的氨基酸序列同源性都超过95 %。亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂各自与意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原氨基酸序列的同源性分别为95 8%、10 0 %、97 2 %、97 2 %。结果表明 :蜂毒前溶血肽原一级结构序列具有很高的保守性 ,尽管胡蜂和蜜蜂属于膜翅目不同的总科 。

4种海参16S rRNA和COI基因片段序列比较及系统学研究

采用PCR技术对来自山东荣成、长岛、俄罗斯和日本的刺参(Apostichopus japonicus),来自澳大利亚的黄乳海参(Holothuria fuscogilva),来自冰岛的北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)和来自福建的二色桌片参(Mensamaria interce-dens)的16SrRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为500bp和540bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数进行基因序列变异分析。结果表明,根据16SrRNA、COI基因片段进行刺参种内差异比较时,长岛和荣成刺参序列差异最小,和日本刺参序列差异最大;刺参和其他科3种海参种间的序列差异远远高于刺参种内差异。从GenBank中选取7条海参序列与本研究所测序列一同构建了NJ和ME系统树。根据2种基因片段的系统学分析均表明,刺参属和拟刺参属亲缘关系很近,可能有共同的起源。而海参科未与同属于楯手目(Aspidochirolida)的刺参科聚类,而与枝手目瓜参科和沙子鸡科聚为一支,与形态学的分类不一致。

特超强毒648株马立克氏病病毒的囊膜糖蛋白gE基因的克隆和序列比较

鸡马立克氏病毒特超强毒 (vv+MDV) 648株的囊膜糖蛋白 gE基因经PCR扩增并克隆入pUC1 8载体。 648株gE基因经核酸序列分析测定 ,全长为 1 494碱基。所编码的蛋白具有跨膜糖蛋白的一些特征。它含有 8个潜在的糖基化位点、N端有一段疏水区 (1～ 1 9aa)所构成的信号肽、C端有一段疏水区 (391～ 41 9aa)所构成的膜锚着序列。经 648株 (vv+MDV)和马立克氏病毒强毒 (vMDV)GA株的 gE相比较 ,在MDV血清 1型中 gE是较为保守的 ,二者仅有 2个核苷酸的差异 (第 51 2位、第 1 472位 ) ,并导致了有二个相应的氨基酸的改变 (第1 71位Leu/Pro、第 491位Arg/Lys)。

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)原型株 HPRS- 10 3基因组碱基 #5 394～ #5 416及 #7811～ #7794的 1对引物做 PCR,在 2 0 0 0～ 2 0 0 1年从山东、河南和宁夏分离的 8株 AL V- J中 ,有 6株可以扩增出含 gp85基因的 2 .2 kb左右的特异性片段。对其中 5株的扩增片段做了序列分析 ,结果表明 ,这 5个毒株的囊膜糖蛋白 gp85与原型株 HPRS-10 3有 93.4%～ 96 .8%的同源性 ,与我国最早的分离株 SD990 2有 93.7%～ 98.7%的同源性 ,它们相互之间的同源性为 91.2 %～ 98.7%。由此说明 ,我国 AL V- J的 gp85基因正在不断发生变异。

第46代鸡贫血病病毒细胞凋亡素基因的体外扩增、克隆、序列比较

通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增了第 46代鸡贫血病病毒 (CAV)Cux株的细胞凋亡素 (Apoptin)基因 ,并克隆入pGEX_5X_3质粒载体中。通过限制性内切酶分析、序列测定 ,验证了克隆的正确性。细胞凋亡素基因全长为 36 3bp ,编码 12 1个氨基酸。与Meehan .等发表的CAVCux株序列相比 ,第 46代细胞适应毒的细胞凋亡素基因的第 2 0 9个核苷酸由CT ,与澳大利亚株、美国株CAV序列分别有 5个和 2个碱基的差别 ,并且均匀分布在 5’端前 2 10碱基区 ,而在 3’端序列较为保守。与同处欧洲的英国株CAV序列相比 ,序列较为一致。本研究对所克隆的调亡素编码蛋白进行了疏水性分析和抗原表位优势分析。

水稻条纹病毒云南分离物CP基因克隆及序列比较分析

对采自云南保山、楚雄、石林和宜良等4地的水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA,经RT-PCR扩增,获得4个RSV云南分离物的CP基因片段。序列测定表明,该片段长999 bp,其中CP基因由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。与其它已报道的RSV分离物CP基因进行同源性比较,发现我国RSV分离物可以划分为2个不同的组,大部分RSV云南分离物为一组,其它的RSV分离物为另一组。以RSV-CX i分离物的CP与纤细病毒属的其它5种病毒的CP进行氨基酸同源性比较,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,而与RGSV亲缘关系最远。

小麦纹枯病菌核糖体基因内转录区序列比较

对 7个从江苏省小麦纹枯病样本分离到的丝核菌菌株,进行形态学鉴定、融合群分类和致病性测定,提取病菌的DNA,采用通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC),扩增病菌的rDNA内转录区(ITS),并对扩增产物进行了测序。用这些序列在NCBI中进行BLAST分析,得到与这些菌株亲缘关系最近的菌株序列,并明确了这些菌株的分类地位。对以上的菌株序列进行Alignment分析,结果表明,病菌的 5. 8SrDNA序列高度保守,而ITS区的可变性则相对较高,在双核和多核丝核菌、双核丝核菌CAG1融合群和非CAG1融合群菌株间存在差异,可用于反映菌株间的进化关系和双核丝核菌种下分类。

不同抗冷性水稻中编码甘油-3-磷酸转酰酶的部分cDNA的序列比较研究

采用RT -PCR技术 ,以根据国外报道的几种双子叶植物的甘油 - 3-磷酸转酰酶的相对保守的氨基酸序列而设计的简并引物作为扩增引物 ,从不同抗冷性水稻品种中均扩增到一段约 315bp的cDNA片段。测序结果表明它们都是编码GPAT的部分cDNA ,含有 315个核苷酸 ,编码 10 5个氨基酸。比较它们之间的核苷酸及推导氨基酸序列 ,发现有一定差异 ,且抗冷性相差越大的品种间差异越大。抗冷性的差异可能与脯氨酸的替换有关。

猪肺炎支原体表面蛋白P46基因的克隆与序列比较

猪肺炎支原体 (MycoplasmaHyopneumoniae ,Mhp)兔化弱毒株R6 5 9株、济南强毒株、强毒Z株、国际标准株2 32 ,通过A2 6培养基培养 ,提取DNA ;利用PCR技术从四株猪肺炎支原体中均能扩增出目的条带。将该序列克隆到pGEM_T_Easy载体上测序。结果表明 ,克隆序列全长 115 2bp ,编码 383个氨基酸和一个终止子 (TAA) ;该序列中含有 3个TGA编码Trp ,而不是终止密码子。比较兔化弱毒株与济南强毒株、国际标准株 2 32及NCBI上发布的J株的P4 6基因序列 ,发现它们的同源性分别为 98 6 %、99 2 %、99 2 % ;比较它们编码的氨基酸发现它们的同源性分别为 98 7%、99 2 %、99 2 %。结果表明猪肺炎支原体的P4 6基因在猪肺炎支原体种内是很保守的 ,因此建立以P4 6蛋白为诊断抗原的ELISA具有潜在的意义。

基于有向图的活动序列比较及其在装配序列评判中的应用

在分析活动序列内涵的基础上,提出了用于描述活动序列及评价指标参考序列的两个模型———完全AOV网和扩展AOV网,给出了一种基于有向图的活动序列相似度的计算方法,实现了工程任务安排决策中活动序列方案对各评价指标满足程度的量化计算。在装配序列规划中的应用实例表明,该方法较好地解决了工程任务安排决策中方案的自动评价与选择问题。

一株鸡传染性贫血病毒野毒株致病性及其全基因组序列比较

从山东某商品代肉鸡场表现生长迟缓的14日龄病鸡群分离到一株鸡传染性贫血病毒（CAV）C14株。C14株感染1日龄SPF鸡能抑制对禽流感病毒（AIV）的抗体反应,还能与禽网状内皮增生病病毒（REV）在免疫抑制上起协同作用。用PCR方法分段扩增出C14基因组的三条部分重叠片段,分别克隆于T载体并进行测序,拼接后得到其全基因组序列。测序结果表明,CAV-C14株基因组全长2298bp,含有3个互相重叠的开放阅读框和1个调控区。将C14与国内外已发表的CAV参考株基因组比较,同源性为97.2%~99.2%。序列比较表明CAV非编码区中含有的多个与复制及转录调控相关已知基序的序列都非常保守。CAV的3个编码基因VP1、VP2和VP3均有一定程度变异,以VP1变异性最大,且不同毒株间的3个蛋白质氨基酸序列的变异是互不相关的。

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA1片段序列比较

首次测定了我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的RSV 2个分离物RNA1片段的全长序列,这2个分离物RNA1片段的全长序列均为8970 nts。同源性分析结果表明,HZ与日本T分离物的亲缘关系较CX与T分离物的亲缘关系更为接近。通过对纤细病毒属病毒RNA1编码的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)氨基酸序列分析的结果表明,该蛋白除了具有RNA聚合酶特征的基元序列结构外,还存在mRNA的转录过程中所采取的加帽起始机制的保守性结构域位点,这表明,纤细病毒属病毒和布尼安病毒科病毒及甲型流感病毒一样,都是采取加帽起始机制进行转录的。

不同动物源大肠杆菌gapA看家基因的克隆及序列比较

3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH/G3PDH)是糖酵解反应的关键酶,为生命体的各种生命活动提供能量。在大肠杆菌中,GAPDH由看家基因gapA编码。本研究对不同动物源的大肠杆菌菌株(包括禽源致病性大肠杆菌(APEC)分离株O1和CE129、人源肠致病性大肠杆菌(EPEC)菌株738、人源益生菌Nissle1917和猪源表达F18菌毛大肠杆菌标准株F107/86的gapA基因进行PCR扩增、克隆测序,并与GenBank中8株菌株序列比较,发现其核酸序列虽有少数位点的突变,但是氨基酸序列仍保持完全一致,从分子基础上保证了GAPDH的酶活性。本研究验证了原核病原微生物,尤其是大肠杆菌gapA基因转录翻译的GAPDH蛋白的高度保守性,为制备大肠杆菌专用内参蛋白抗体提供可能,并进一步为对致病性大肠杆菌的蛋白代谢通路和合成生物学研究提供了基础材料。

乙型脑炎病毒野毒株及其不同株减毒株E蛋白基因序列比较

为了解乙脑减毒活疫苗株SA14 14 2的神经毒力减毒机制 ,用RT PCR方法分别扩增不同减毒程度毒株的E基因 ,克隆、测序 ,继而对各毒株序列进行比较。结果表明SA14 强毒株与SA14 12 1 7株间只有 3个氨基酸发生改变 (E 10 7,E 176 ,E 4 39) ,SA14 12 1 7与SA14 9 7和SA14 5 3株间有另 3个氨基酸发生改变 (E 138,E 2 79,E 315 )。SA14 9 7株与SA14 5 3株只有一个核苷酸NT 4 0 5不同 ,但未引起氨基酸改变。SA14 14 2疫苗株除保留SA14 12 1 7和SA14 9 7所改变的 6个氨基酸外 ,另有 2个氨基酸发生了改变 (E 177,E 2 6 4 ) ,共计在E区共发生 8个氨基酸的替代。SA14 12 1 7株的低神经毒力很不稳定而其余各株的弱毒特征很稳定。因此 ,E 176 (Ile→Val) ,E 4 39(Lys→Arg)和E 10 7(Leu→Phe)可能与神经外和神经内毒力减弱有关。E 138(Gul→Lys) ,E 315 (Ala→Val)和E 2 79(Lys→Met)

不同致病型马立克氏病病毒1.8kb基因家族序列比较

为了分析鸡马立克氏病病毒(Marek′sdiseasevirus,MDV)的致病性与其1.8kb基因家族的关系,本研究比较了四个不同致病型12个毒株的该基因家族的同源性关系,即弱毒疫苗株、强毒株、超强毒株、特超强毒株和中国野毒株。结果表明:不同毒株间1.8kb基因家族的上游调控序列的同源性在1.8kb基因家族转录方向上大于92.5%,序列间有缺失突变,其中大多数突变发生在弱毒株上。CVI988在TATAbox和上游SP1位点间丢失小片段“5′CTCGG3′”。1.8kb基因家族中存在132bp串连重复序列,CVI988包含37个132bp串连重复序列拷贝,强毒株、超强毒株、特超强毒株通常只包含2个串连重复序列。但是已知的中国疫苗毒株814株也只有2个重复序列,表明重复序列的拷贝数不是引起病毒毒力变化的主要原因。各毒株的1.8kb基因家族同源性在97%以上。其中未剪切的1.69kbcDNA中有两个阅读框,分别编码63和64个氨基酸组成的多肽。不同毒株的这二个多肽都很保守,虽然也有一些氨基酸变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。

4种梨的多酚氧化酶基因克隆及其序列比较

以4种不同来源的梨基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶基因序列设计引物,利用PCR技术,克隆到了鸭梨、雪花梨、砂梨、黄冠梨约1.8 kb的完整多酚氧化酶基因,将纯化后的扩增产物克隆到质粒pGEM-T vec-tor中,转化DH-5α菌,挑选阳性克隆进行测序。利用Clustalx软件对PPO核苷酸序列进行了同源性分析,用DNAStar软件对PPO核苷酸序列进行进化树分析,并进行部分植物PPO氨基酸的同源性分析。结果表明,4种梨多酚氧化酶基因的蛋白编码区含有1 782个核苷酸,鸭梨基因已经在GenBank上登录,登录号为EU048225。梨多酚氧化酶基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性,尤其在铜离子结合部位,所有的植物基本上一致;5种梨的同源性高达98%。基于植物PPO基因核苷酸序列的分子进化树显示,可分为两大类,梨的多酚氧化酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组。