应用酵母单杂交系统筛选CpG免疫激活序列的特异性结合蛋白

目的 :寻找与 Cp G免疫激活序列 (imm unostimulatory sequence,ISS)有选择性相互作用的蛋白 ,以进一步探讨其分子作用机制。 方法 :采用酵母单杂交系统 ,以 4重复的 ISS为“诱饵”,对人骨髓细胞 c DNA文库进行初步筛选 ,并对部分阳性克隆以电泳迁移率变动分析 (EMSA )进行验证。结果 :已获得 4个双阳性克隆 ,其中两个编码功能未知的蛋白 ,而另外两个均属抗体轻链 ,分别与抗 DNA抗体和抗乙肝表面抗原抗体 (HBs Ab)高度同源 ;EMSA发现 HBs Ab可在偏酸 p H条件下 (p H6 .4和 5 .8时 )特异性地与含 ISS的寡核苷酸 (Cp G- ODN)结合。 结论 :HBs Ab可与

碳纳米管修饰金电极检测特定序列DNA

利用化学偶联法将末端修饰氨基的寡聚核苷酸固定在表面修饰有羧基化碳纳米管(CNTs-COOH)的金电极表面,制备新型核酸探针,可以特异性结合目标单链寡聚核苷酸.以阿霉素作为嵌合指示剂,利用示差脉冲法测定杂交的结果.经过实验条件的优化,测定DNA浓度在1.0×10^(-6)～1.0×10^(-9)mol/L呈良好的线性关系.检测限为:2.54×10^(-10)mol/L.碳纳米管特有的纳米结构对检测结果的放大作用,提高了该传感器的检测限和灵敏度.

乙型脑炎病毒寡核苷酸基因芯片研究

目的:制备检测乙型脑炎病毒寡核苷酸(oligo)基因芯片。方法:应用生物信息学软件设计60-meroligo探针用于制备基因芯片,乙型脑炎病毒(JEV)基因片段经限制性显示技术扩增标记,用于芯片杂交,清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果:大部分oligo探针都能特异性与相应样品杂交,呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。结论:实验中建立的oligo基因芯片检测病原体方法可行,具有应用于临床诊断的前景。

荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌

[目的]建立应用荧光标记寡核苷酸探针BC73快速检测变形链球菌的方法。[方法]应用流式细胞仪检测荧光标 记寡核苷酸探针EUB338和BC73与模式菌株和牙菌斑样品荧光原位杂交后的荧光强度和荧光计数。[结果]荧光标记寡核苷 酸探针BC73与变形链球菌S. mutans 10449杂交的荧光强度7倍于S.mitis 15914和E. coli K12。变形链球菌占牙菌斑中细 菌总数的1.7％。[结论]荧光标记寡核苷酸探针BC73能特异性检测牙菌斑中的变形链球菌数。

自行构建人类白细胞抗原DQA1位点基因分型寡核苷酸芯片性能评价:100例样本与PCR-SSP法的比较

背景:人类白细胞抗原等位基因分型对器官移植和法医鉴定等有重要意义。目前的分型方法难以实现高通量和集成化,准确性和重复性也不理想。目的:比较自行构建的寡核苷酸芯片与序列特异性引物-聚合酶链反应(polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP)两种方法用于人类白细胞抗原DQA1基因分型的结果,以评价寡核苷酸芯片的性能。方法:纳入2006-01/2009-03于中国医科大学附属第一医院血液科门诊就诊的患者100例。分别用等位基因特异的PCR-SSP和自行构建的寡核苷酸芯片对患者的人类白细胞抗原DQA1进行分型。寡核苷酸芯片分型采用荧光标记的组间特异性引物扩增基因组DNA,扩增后的产物与分型芯片的探针杂交,由杂交产生的荧光信号确定人类白细胞抗原DQA1位点基因型。比较两种方法分型所获得的结果,不吻合的样本经第三方测序验证。结果与结论:100例临床样本经寡核苷酸芯片和PCR-SSP分型全部成功。分型结果的吻合率为94%。不吻合样本6例,其中4例PCR-SSP定型为杂合子,芯片分型全部为纯合子。经第三方验证,证实芯片的分型全部正确。另外2例不吻合的样本经测序,证实SSP分型错误1例,芯片分型错误1例。芯片的重复率为95%。说明自行构建的寡核苷酸芯片的特异性和灵敏度都能满足基因分型的需要,且稳定性较好。

端粒酶反义寡核苷酸对食管癌细胞Eca-109端粒酶活性及细胞凋亡的影响

目的探讨人端粒酶反义寡核苷酸(PS-ASODN)对食管癌Eca-109端粒酶活性及细胞凋亡的影响。方法1-5uM的PS-ASODN、5uM的N-ASODN作用于Eca-109细胞后,在倒置显微镜下连续观察Eca-109细胞形态学改变;采用半定量TRAP-银染法检测端粒酶活性;用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期变化。结果PS-ASODN对Eca-109细胞具有生长抑制作用,PS-ASODN作用后,细胞的生长速度缓慢,细胞体积缩小,部分细胞变形漂起。随着药物浓度增加,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增强,呈浓度依赖性和序列特异性。流式细胞仪检测到凋亡峰并受阻于G0/G1期,而对照组寡核苷酸无上述作用。结论PS-ASODN不但抑制食管癌的增殖,降低端粒酶的活性,而且具有促凋亡的作用,对食管癌的临床治疗具有重要的价值。

丝球小奥德蘑白色菌株特异性标记开发

丝球小奥德蘑(Oudemansiella apalosarca)菌株JZB2115081是一株颜色洁白但菇柄短、易开伞、产量低的菌株;而丝球小奥德蘑菌株JZB2115055是一株产量高,菇型好但子实体整齐度不高的菌株。目前生产上除出菇试验外,缺乏快速区分鉴定2种菌株的方法,在一定程度上阻碍了杂交育种工作进程,因此试验采用27个ISSR引物同时对2个菌株的DNA模板进行PCR扩增,回收菌株JZB2115081的特异性扩增条带,通过克隆、测序获得7条特异性条带的DNA序列,并设计特异性引物对。最终筛选得出2对特异性扩增丝球小奥德蘑菌株JZB2115081的扩增标记(引物对8071F/R、8122F/R),从而可快速区分菌株JZB2115081与菌株JZB2115055,为后期选育具有JZB2115081菌株特性且兼有菌株JZB2115055优良性状的杂交新菌株奠定基础。

沈阳汉族群体HLA Ⅰ类基因座PCR-序列特异性寡核苷酸探针分型研究

目的检测和分析沈阳汉族HLA-A、-B、-Cw位点等位基因的多态性。方法采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针杂交分型方法对108名沈阳籍健康献血员进行HLA-A、-B、-Cw等位基因分型。结果检出等位基因HLA-A位点21个,B位点43个,Cw位点23个;所有位点的等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论从基因水平分析了HLAⅠ类基因的群体分布特征,提供了沈阳汉族群体HLAⅠ类基因座更准确的基因频率。

流式细胞仪结合序列特异性寡核苷酸探针基因分型方法在血小板供者资料库建立中的应用

目的探讨高通量流式细胞仪结合序列特异性寡核苷酸探针（FLOWlSs0）技术在人类血小板抗原（HPA）基因分型中的应用。方法采用FLOW—SSO技术对1378例汉族血小板捐献者HPA1～6，15系统的基因型进行检测；并以10份国际输血协会（IsBT）第12届血小板免疫学术研讨会提供的质控样品对FLOW-SSO技术的可靠性进行考核。以3家供应商提供的不同聚合酶链反应一序列特异引物法（PCR—SSP）试剂，对50份血小板样品的基因分型结果进行比对试验。分型结果采用Y。检验考察HPA系统的基因型频率分布是否符合Hardy—Weinberg遗传平衡定律。结果通过FLOW-SSO方法获得的1379例血小板供者HPA等位基因频率如下，HPA—1a为0．9927，HPA-1b为0．0073，HPA-2a为0．9536，HPA-2b为0．0464，HPA-3a为0．5700，HPA-3b为0．4300，HPA-4a为0．9982，HPA-4b为0．0018，HPA-5a为0．9804，HPA-5b为0．0196，HPA-6a为0．9822，HPA-6b为0．0178，HPA-15a为0．5337及HPA-15b为0．4663。基因频率检测结果经Y。检验，其分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。ISBT提供的10份样品考核结果相符率为100％。50份血小板样本采用3种不同的PCR—SSP试剂测定的HPA1～6，15基因分型结果，与FLOW—SSO技术测定结果完全一致。结论FLOW—Ss0基因分型技术有便捷、重复性好及高通量等特点，适用于血小板供者资料库的血小板基因分型。

反义寡核苷酸的动物模型研究

寡核苷酸能以序列特异性方式抑制基因表达已有记载。寡核苷酸因具有敏锐的特异性,已被推荐用于治疗多种人类疾病,其疾病包括癌症、微生物感染和自身免疫病。目前约有16个临床试验正在实施。然而,对寡核苷酸在体内表现所知甚少。由体外研究推断,人体内药代动力学和作用效果可能是困难的和不适当的。动物模型仍是寡核苷酸开发成人体有效药物的一种基本工具。

应用反向斑点杂交技术进行脐血HLA-DRB基因分型方法的建立

HLA分子的多态性对于移植有十分重要的意义。常用的HLA基因分型方法中SSOP基因分型方法有较高分辨率 ,但操作过程复杂 ,仅适于大样本的HLA分型。PCR SSP基因分型方法分辨率较低 ,但操作过程简单 ,适于临床要求。有必要建立一种简便、快速、价廉、高分辨率的基因分型方法。本研究取 6 3份已知HLA DRB型的脐血标本 ,经盐酸胍方法提取DNA用于反向斑点杂交 (RDB)基因分型 ,同时采用SSOP和PCR SSP方法进行比较。结果表明 ,所有样本用RDB方法基因分型均获得成功 ,可准确地分辨 6 0个HLA DRB等位基因 ,且结果与用SSOP和PCR SSP方法的结果完全一致。结论提示 ,RDB方法可准确地分辨HLA DRB等位基因 ,分辨率高 ,操作简单 。

36380名河北汉族HLA供者基因多态性及其分布特征

目的了解河北省汉族人群人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1基因多态性及分布特征。方法采用序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-Sequence Specific Oligonueleotide Probing,PCR-SSOP)方法,对36 380名河北汉族捐献造血干细胞健康志愿者的HLA-A、B、DRB1基因作低分辨基因分型检测,采用方根法计算HLA-AB、DRB1基因频率,并进行群体比较。结果河北汉族人群中共检出18个HLA-A基因43个HLA-B基因和14个HLA-DRB1基因,呈现较高的基因多态性,包括过去很少被检测到的HLA-A*25,A*74,B*42,B*53,B*73,DR*18。,其中A座位最常见基因依次为:A*02、A*11、A*24、A*30、A*01、A*03、A*33 B座位最常见基因依次为:B*13、B*1501(B62)、B*51、B*4002(B61)、B*4001(B60)、B35,B46DRB1座位最常见基因依次为DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*04、DRB1*11和DRB1*14,结论河北汉族人群HLA-A、B、DRB1基因分布有自己的特点,各基因频率介于南北汉族之间,但更接近于中国北方汉族人群,符合地域分布特征。

一例白血病患者及家系HLA-B基因全长序列及18个点突变分析

背景:人类白细胞抗原HLA经过长期进化形成丰富的多态性,近几年由于受检人数增加及HLA分型技术快速发展,HLA新基因不断被发现。目的:采用下一代测序技术对1例白血病患者及家系HLA-B基因的全长序列及18个点突变进行分析。方法:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)及聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)发现患者的HLA-B结果异常。为了鉴定该基因,采用下一代测序技术对该基因全长进行测序,同时采集患者父亲、母亲及2位同胞姐妹的血样进行HLA基因的遗传学分析。结果与结论:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交及聚合酶链反应-直接测序法均提示该样本HLA-B无完全匹配的基因型。应用下一代测序技术分析发现,与同源性最高的等位基因B*15:09:01相比,该基因在外显子、内含子和3′UTR共存在18个碱基突变。5个外显子碱基突变位于第3,4外显子,分别为:第486位G→C、第583位T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T,导致5个相应密码子发生改变,其中2个碱基替换为错义突变,第171位酪氨酸(Tyr)→组氨酸(His)、第194位异亮氨酸(Ile)→缬氨酸(Val)。家系调查显示患者HLA-B新基因来源于父亲。新基因序列已递交给Genbank数据库(MG595995)。应用下一代测序技术鉴定了1个HLA-B新等位基因,该基因于2017年12月被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:435。

流式磁珠反向SSOP杂交法误判HLA基因型的原因分析(附4例报告)

目前对人类白细胞抗原的基因分型技术有多种,包括序列特异性引物-聚合酶链反应（polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP）,多聚酶链反应序列特异性寡核苷酸探针（PCR-sequence specific oligonucleotide probe,PCR-SSOP）杂交法,基因芯片法和DNA直接测序法（sequence-based typing,SBT）。基于Luminex的流式磁珠反向SSOP杂交法具有快速、高准确率、高通量、重复性好等优点,

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。

反向点杂交法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的 建立快速方便的反向点杂交法 (RDB)检测中国人N 乙酰化酶 (NAT2 )基因型。方法 采用PCR法扩增生物素标记的DNA片段 ,与固定在尼龙膜上的等位基因特异性寡核苷酸探针进行杂交 ,通过非同位素法显色检测杂交结果 ,分析NAT2 5种主要突变位点。用本法对 4 8名肺结核患者NAT2基因型进行了分析。结果 RDB法与等位基因特异扩增法结果完全一致。 4 8名肺结核患者NAT2 5、 6、 73种突变型等位基因的基因频率分别为 1 0 4 %、2 2 9%和 15 6 %。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为 33 3%、5 4 2 %和 12 5 %。结论 RDB法检测NAT2基因型准确、方便 ,适用于指导临床合理用药。

荧光原位杂交检测野生六出花(Alstroemeria aurea)染色体命运

利用从野生六出花 (Alstroemeriaaurea)中分离的一个种特异性串联重复序列 (A0 0 1 I)作荧光原位杂交的探针 ,检测野生六出花染色体在其一系列杂交后代中的命运。试验结果表明 ,除最长的一对染色体外 ,该方法能够检测到在其一系列杂种后代中其余 7对染色体是否存在。

序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46

背景:近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。目的:探索中国人的人类白细胞抗原新等位基因。方法:应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术,对1名27岁男性汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果与结论:PCR-序列特异性寡核苷酸探针结果显示该样本HLA-B基因座反应格局出现异常提示;基因测序结果表明其B基因座第3外显子序列与所有已知HLA-B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列最相近的等位基因B*55:02:01的差异只是在第3外显子发生了nt 412 A→G一个核苷酸替代,导致第138位密码子由AAC→GAC,相应的编码的天冬酰胺改变为天冬氨酸。将其序列提交国际基因数据库及IMGT/HLA数据库,证实该HLA等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA-B*55:46(HM989018)。

~3H标记DNA探针进行染色体原位杂交

近年来,由于重组DNA技术在医学科学上的应用,使遗传病的诊断从表型水平、蛋白质水平及染色体水平跨入核酸水平,从而形成了基因诊断的新领域。染色体原位杂交是一种简便、直接、精确的染色体基因定位方法。我们用~3H标记人Y染色体特异性DNA探针(PY3·4)进行染色体原位杂交。