金嗓清音丸中僵蚕成分的特异性引物扩增鉴定

目的建立特异性引物扩增鉴定金嗓清音丸中僵蚕成分。方法根据家蚕、白僵菌、绿僵菌线粒体全基因序列差异设计特异性引物PM2、PB2、PA2,采用十六烷基三甲基溴化铵法、酚仿抽提法提取纯化总DNA,并以此为模板进行特异性引物扩增和方法学考察,产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果家蚕、白僵菌、绿僵菌DNA经PCR扩增后,分别在82、94、144 bp处产生条带,并且未观察到非特异性扩增条带。PM2、PB2、PA2对相应DNA的检测灵敏度分别为0.10、0.10、0.010 ng/μL。来自同一厂家的6批样品中同时检出家蚕、白僵菌DNA,但未检出绿僵菌DNA,而另外2批样品仅检出家蚕DNA。结论该方法方便可靠,专属性强,有助于更好地监控金嗓清音丸等含僵蚕中药成方制剂的质量,可为其临床用药的安全性和有效性提供保障,并为其他中成药中动物药的专属性鉴定提供参考。

花鲈虹彩病毒交叉引物恒温扩增检测方法的建立

【目的】花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV)严重威胁花鲈养殖业安全,无特效防控药物,早期诊断在LMIV防控中发挥极其重要的作用。建立一种简便、快捷、准确的现场快速诊断方法,可为LMIV的基层诊断提供技术支撑。【方法】利用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA),针对LMIV ATPase基因高保守区设计1套单交叉引物。以构建的ATPase重组质粒作为阳性模板,对反应体系中的引物浓度比,Bst DNA聚合酶、Betaine、MgSO_(4)、dNTP浓度,以及反应温度和反应时间进行优化;结合一次性核酸试纸条,建立可视化检测LMIV-CPA的方法。【结果】最优引物浓度比组合为交叉引物CPF1.0μmol/L,引物F3和B3均为0.4μmol/L,探针引物B1(FAM)和B2(Biotin)均为0.8μmol/L;MgSO4浓度为6 mmol/L、Betaine浓度为0.4 mol/L、dNTP浓度为0.6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为0.256 U/μL;最佳反应温度为62℃,最佳反应时间为45 min。扩增产物经凝胶电泳检测呈梯形条带,带有探针的反应产物采用一次性核酸试纸条检测装置进行检测,在3~5 min内即可通过是否出现特征性条带而使反应结果可视化。该方法可特异性地检测出LMIV,不与其他水生常见病毒和常见细菌发生交叉反应。使用LMIV-CPA方法和常规PCR方法共同检测156份临床样品,LMIV-CPA的阳性检出率为93.30%,常规PCR方法的阳性检出率为85.83%;在比较二者的灵敏度差异时,LMIV-CPA的检测限为102 copies/μL,灵敏度为常规PCR的10倍,综合结果显示LMIV-CPA优于PCR。【结论】LMIV-CPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于LMIV的现场快速检测,为花鲈LMIV的准确快速诊断和有效防控提供技术支撑。

引物3’端不同碱基错配情况下实时荧光定量PCR非特异性扩增的发生规律

以错配反应与正常反应之间的ΔCt值为指示,研究不同碱基错配类型、位置与个数条件下引物3′端与模板之间非特异性扩增的发生规律,并构建ΔCt值的二次多项式回归模型。结果表明,碱基错配种类、位置、个数对实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR)的非特异性扩增都有显著影响,并呈现出较强的规律性。碱基类型上,研究的各个位置上异型错配较易发生非特异性扩增,而同型错配则较难发生,并且两种错配类型之间有显著性差异(P<0.05);错配位置上,相同条件下引物3’端第1位碱基错配对ΔCt值影响最大,错配位置远离3’端时对ΔCt值的影响逐渐减小,非特异性扩增也更容易发生;错配个数上,随着错配碱基个数的增加对ΔCt值得影响程度不断增大,非特异性扩增较难发生。构建ΔCt值预测模型R2达到0.837 1,根据此模型可以预测出不同位置、不同错配类型条件下ΔCt值,从而可以判断RT-q PCR非特异性扩增的发生的难易程度。

等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率

本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。

用三引物法提高PCR的扩增效率及特异性

聚合酶链反应(PCR)现已广泛应用于分子生物学研究的各个领域。对于模板量较低的样品及单拷贝基因,通常通过增加扩增的次数或多次PCR提高扩增的效率,但这样往往出现非特异性反应。本文采用三引物双扩增法大大提高了PCR扩增的效率及特异性。 1 材料与方法 Melanoma细胞由本室保存,能分泌人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。RT

基于随机扩增多态DNA的序列特异性扩增标记法对乌苏里貉食毛症的分析

貉（Nyctereutes）在动物分类上属食肉目（Carnivora）,犬科（Canidae）,貉属（Nyctereutes genus）,别名貉子,是珍贵的毛皮动物。其皮是制做皮大衣、皮领、皮帽的高级原料。食毛症是笼养貉的常见病,该病导致貉被毛粗乱,轻者造成针毛、底绒参差不齐,尾根裸露;严重者皮肤外露,甚至出血、

聚合酶链反应-序列特异性引物方法检测儿科疾病基因多态性

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在儿科疾病分子水平研究中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性,TNF-α-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多基因的多态性进行分析,成本低、快速、准确,在儿科疾病分子水平研究中前景良好。

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.

氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增效率、灵敏度和特异性的影响

以人类基因组DNA和志贺氏菌粗制裂解菌液为模板,扩增115 bp的Alu基因片段和402 bp的ipaH基因片段.通过设置氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)和模板的浓度为变量,分别研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增效率和灵敏度的影响;运用多轮PCR扩增方法研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增特异性的影响.结果显示,氧化石墨烯有效提高PCR扩增效率的范围为9—14倍,提高PCR灵敏度一个数量级以及增加多轮PCR扩增中的两轮扩增反应.从原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)的结果可以看出,本文制备的氧化石墨烯片层厚度主要集中在0.5—0.8 nm,少数大于1 nm,总体具有较大的比表面积.除此之外,本文还发现当氧化石墨烯浓度到达μg·μL^(-1)后,引物二聚体与氧化石墨烯的浓度呈正比,说明氧化石墨烯优化PCR的主要影响因素是其与引物的相互作用.

金纳米粒子对聚合酶链式反应体系中长链DNA特异性扩增的效应

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性扩增，有效降低了非特异性扩增。在ETR1和SDH的PCR中，金纳米粒子适宜浓度为0．4nmol·L^-1。在50℃-62℃的退火温度范围内，金纳米粒子均能够显著增强ETR1和SDH的特异性扩增。因此，金纳米粒子不仅提高了1000bp以上的长链DNA在PCR扩增的特异性，而且拓宽了PCR的退火温度范围。

聚合酶链式反应-特异性序列引物基因定型在新生儿溶血病ABO血型定型中的应用

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PCR-SSP)基因定型在新生儿溶血病(CHDN)ABO血型定型中的应用。方法收集20例来自广东省肇庆市第一人民医院新生儿溶血病(HDN)的样本,对这些样本进行ABO血型鉴定等一系列血型血清学方法进行检测,然后用PCR-SSP基因定型技术进行样本的基因分型。结果与其血型的血清学分型结果进行比较,新生儿溶血病ABO血型的定型是新生儿输血的必要保障,而PCR-SSP基因分型较血型血清学方法更快捷、准确。结论 PCR-SSP基因正型技术将不再局限于疑难血型的鉴定中,并会越来越多地应用于HDN的鉴定中。

过量DMSO显著降低低模板浓度PCR扩增的特异性

DMSO通常经验性地用于提高PCR扩增的效率 ,但是过量的DMSO可以显著降低特异序列的扩增效率 ,尤其是导致非特异性扩增的现象却被忽视。在 6 %的DMSO存在时 ,开始出现非特异条带 ,同时特异扩增产物减少。本文首次报道DMSO对PCR产物特异性的影响并确定了克服上述现象产生的途径 ,即通过增加模板 -引物的比例消除非特异条带。而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物 ,不能避免非特异扩增。本文结果有助于提高常规PCR ,尤其是分子遗传学分析中经常使用的随机扩增多态性DNA (randomamplifiedpolymorphicDNA ,RAPD)检测的准确度。

基于分子生物学特异性扩增的方法鉴别菲牛蛭

目的:通过DNA条形码鉴定和建立特异性引物扩增的方法,有效区分菲牛蛭与其他水蛭品种。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对水蛭样品的COI序列进行扩增,利用MEGA 6.06软件通过建树法进行NJ树聚类分析,针对菲牛蛭素的编码基因序列、利用Primer Premier 5软件进行引物设计,对经设计、合成的8对引物通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验进行筛选,并确定特异性引物的最佳退火温度。结果:通过COI序列的NJ树聚类分析可以确定20批水蛭样品中的9批菲牛蛭样品,经过Primer Premier 5软件进行引物设计共选出8对引物进行合成,通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳预实验筛选出引物7、为最佳实验引物,且确定了引物7的最佳退火温度为49℃。结论:通过COI序列的DNA条形码研究,确定了样品中的菲牛蛭,通过特异性引物PCR扩增和电泳检测,有效地将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分,为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。

建立序列特异性引物PCR检测儿茶酚胺氧位转移酶与单胺氧化酶基因多态性的方法

目的建立用PCR-SSP检测儿茶酚胺氧位转移酶(COMT)与单胺氧化酶(MAOA)的基因多态性的方法。方法根据COMT与MAOA的基因序列,采用针对变异位点的点突变方式设计出顺序特异性引物(SSP)进行PCR扩增,并借助常规电泳确定基因型。结果用PCR-SSP来研究COMT与MAOA基因多态性的方法特异性强,重复性好,而且简便、经济、快速。结论PCR-SSP可对具有单核苷酸突变的基因分型,应用前景良好。

提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量

聚合酶链式反应(PCR)技术仅产生数年,却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域。它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段,用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面。目前PCR扩增DNA片段长度可达到近50kb,这在生物学研究特别是在基因组图谱的绘制和测序中将起到革命性作用。扩增片段的能力达到近20～50kb,也将具有其它潜在的应用价值,如可以分离出完整的基因。

基于物种特异性单一DNA标记扩增检测的食品真实性定性鉴别技术研究进展

脱氧核糖核酸(DNA)分析技术已经成为食品真实性鉴别中物种源性成分鉴定最主要也是最有效的技术,其中基于物种特异性单一DNA标记扩增检测的食品真实性定性鉴别技术是最准确可靠,也是目前最成熟、应用最广的技术。本文综述了该技术物种特异性单一DNA标记主要类型及目前常用的扩增检测技术优缺点,并探讨了该技术的未来发展趋势。

基于酶介导双重指数扩增技术(EmDEA)的小火蚁快速检测方法的开发

小火蚁Wasmannia auropunctata是危害性最严重的入侵蚂蚁之一,对动植物、生态、经济甚至是人类都容易造成严重影响,是我国的重大检疫害虫之一。本研究为实现小火蚁的现场快速精准检测,通过自研程序筛选出小火蚁全基因组中的特异性片段,具有更高的特异性,基于酶介导双重指数扩增技术(EmDEA)筛选了适用的引物、RNA探针,全部反应所需时间小于20 min,并验证了其特异性和灵敏度。结果显示这种方法可在短时间内达到极高检测灵敏度与特异性,最低检出限约为4 ng。这种方法极大程度降低对设备的依赖,简单、快速、特异,为小火蚁的基层检测与现场诊断提供技术支持。

五引物单管聚合酶链反应（PCR）扩增法快速测定人CYP2D610等位基因的类型

以人CYP2D6 10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配 碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6 10等位基因 的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快 速,结果准确。

四甲基氯化铵在杨树RAPD扩增反应中的作用

根据 2 0个不同RAPD随机引物对杨树DNA的扩增结果 ,对四甲基氯化铵 (TMACI)在杨树RAPD扩增反应中的作用进行了研究 ,发现TMACI可明显改善杨树的RAPD扩增效果 ,因此TMACI可作为一种有效成分加入杨树RAPD反应体系中。同时比较了不同浓度的TMACI对杨树RAPD扩增反应的影响 ,确定最适合杨树RAPD扩增反应的TMACI浓度为 10～ 5 0 μmol L。利用 3个具亲缘关系的杨树家系对含TMACI的RAPD反应体系的实验结果进行验证 。

应用PCR扩增牛SRY序列进行奶牛胚胎性别的鉴定及移植

本研究是用直接测序技术测定了奶牛SRY的DNA序列,在此基础上设计和合成了牛类SRY特异引物并通过聚合酶链反应(PCR)直接扩增牛胚胎的SRY特异DNA序列,对胚胎进行性别鉴定并移植成功。 研究方法是:由牛静脉血中的白细胞提取DNA,经扩增后直接测定DNA的序列,在此基础上,设计并合成了两对特异于牛SRY序列的PCR扩增引物A、B和C、D。对32头奶牛的白细胞DNA及17枚胚胎(全胚、二分胚、三分胚)的SRY序列进行PCR扩增。实验结果表明,32头奶牛的白细胞DNA 样品,其中有12头公牛样品均显示清晰的特异扩增带,20头母牛样品和空白对照样品均无特异扩增带。17枚奶牛胚胎用引物A、B“一次扩增”结果,有10枚胚胎出现清晰的特异扩增带,另7枚胚胎无特异扩增带,其中2枚三分胚共6个样品,其结果完全一致。用引物C、D进行“二次扩增”的10枚显示特异扩增带的胚胎均显示出另一条清晰的特异扩增带,而另外7枚未显带的样品亦均无特异的扩增带。为验证扩增的SRY序列,特设计了特异于牛SRY的ASO探针(寡核苷酸探针)进行点杂交。结果表明,凡有特异扩增带的均出现阳性杂交结果;相反,无特异扩增带的PCR产物均为阴性杂交结果,证明 扩增的为SRY特异DNA片段。经过性别鉴定的牛二分胚,已有4枚胚胎移植成功。其结果均与胚胎性别鉴定结果相符合。