核酸靶序列的体外选择和扩增技术

核酸靶序列的体外选择和扩增技术王成济（第四军医大学生化教研室，西安７１００３２）关键词寡聚核苷酸，体外选择，ＰＣＲ基因表达的转录水平调控很大程度上依赖于基因的顺式调控元件（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓ）与反式调节因子（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ...

基于环介导等温扩增技术的巴戟天检测方法的建立

目的建立一种可快速检测中药巴戟天的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法针对巴戟天二级内部转录空间(ITS2)序列设计LAMP特异引物组,提取DNA后建立基于LAMP技术鉴别巴戟天的目视和实时定量检测方法,同时评估该方法的特异性、灵敏度及其在实践中的应用情况。结果该检测方法具有良好的特异性,最适反应温度为63℃,灵敏度约为0.10μg/L,比常规聚合酶链式反应(PCR)方法约高10倍。经验证可成功从7种近缘物种中检测出巴戟天。结论巴戟天LAMP检测是一种简便、客观、灵敏、快速的方法,值得进一步推广应用。

等温扩增荧光技术快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

等温荧光扩增技术--Isothermal Amplification Fluorescent Method（IAFT）是核酸体外扩增和荧光法技术的结合,在恒温条件下进行,通过添加特殊的DNA聚合酶和特异性引物,在扩增的同时加入荧光基团,通过荧光信号累积实时监控扩增过程,实现核酸快速扩增和检测,并对产物做溶解曲线分析。本研究针对金黄色葡萄球菌特异性的femA基因片段设计并筛选出了IAFT法的特异性引物,验证特异性和灵敏度,并与传统检测方法做对比,结果符合率为100%。

NASBA技术及其在检验检疫中的应用

序列特异性核酸体外扩增技术(nucleic acid specific-based amplification,NASBA)是在PCR基础上发展起来的一种扩增RNA的新技术,作为一种新型研究手段,具有便捷、准确性好、灵敏度高、周期短的特点,尤其适用于RNA的分析研究。核酸分析技术是出入境检验检疫工作的重要手段,可用于食品病原微生物、动植物产品中的有害生物、病原的分析及鉴定。本文简要介绍了NASBA技术的基本原理,在论证对比NASBA技术与普通PCR方法、荧光PCR方法及其他恒温扩增等核酸分析技术的差异及相似性后,根据其使用特点进一步对NASBA在进出境检验检疫的食品安全检测及动植物检疫的应用予以综述及展望。

NASBA与RT-qPCR技术检测HIV阴性马尔尼菲篮状菌病患者病灶组织真菌载量的效果及相关性

目的探讨序列特异性核酸体外扩增(NASBA)与实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测马尔尼菲篮状菌病(TSM)患者病灶组织真菌载量的效果及相关性。方法采集40例HIV阴性的TSM患者的肩部病灶组织,均采用NASBA与RT-qPCR检测病灶组织马尔尼菲篮状菌的载量。比较两种方法检测结果的相关性及一致性。结果NASBA与RT-qPCR检测的马尔尼菲篮状菌载量差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法的检测结果呈正相关且具有较好的一致性(均P<0.05),但NASBA的灵敏度稍高。结论NASBA与RT-qPCR技术检测HIV阴性TSM患者病灶组织的马尔尼菲蓝状菌载量具有较好的相关性及一致性,但在相同的拷贝浓度下NASBA技术灵敏度更高。

pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达

目的:克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建pEGFP/MOMP真核表达重组质粒,为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据。方法:用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中,阳性重组子经BamHI、KpnI双酶切、PCR扩增及测序鉴定;并经脂质体介导转染HeLa细胞,36h后观察瞬时表达情况。结果:PCR扩增得到约1.2kb的特异性MOMP基因片段;序列测定证实与GenBank登录的D型沙眼衣原体一致;筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP/MOMP。结论:成功地构建了pEGFP/MOMP真核表达重组体,并在HeLa细胞中表达了MOMP。

PCR基因诊断技术

PCR技术(Polymeruse Chain Reaction,PCR)又称体外基因(或DNA)扩增技术,是一种检测特异性DNA靶片段的新方法。在临床检验方法学中,是继细胞形态学。

实时荧光定量聚合酶链反应系统质量管理相关问题探讨

实时荧光定量聚合酶链反应（real-time-polymerase chain reaction,RT-PCR）是体外模拟DNA的天然复制过程,定量或定性测定人类血清、血浆、分泌物等各种体液中的病毒含量及其复制活跃情况。目前,依靠RT-PCR对血液病原体进行筛查已在全国广泛开展,并且因以其高特异性、高灵敏度、低检测限等优势在分子生物学研究的各个领域得到广泛应用。

PCR及其特异性和灵敏度的影响因素

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Re-action,PCR)技术是一种体外特定核酸序列的扩增技术。具有特异、敏感、产率高、快速、简便和易自动化等特点,可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。PCR 技术由 Mullis 及其同事于1985年在 PE-Cetus 公司发明并命名,并因此分享了1993年诺贝尔化学奖。

新技术在微生物检验中的应用

近年，各种生物技术和不同学科解释生命现象的手段与方法在微生物检验中得到应用。病原微生物种类多，生态学特征各异，传统方法很难对所有病原微生物进行准确鉴定。因此，采用新的微生物检验技术对提高感染性疾病诊断有重要意义。分子诊断最常用的技术是针对病原微生物特异性核酸序列，通过核酸杂交或核酸体外扩增，检测标本中是否存在某种病原微生物。蛋白质、多糖等其他大分子检测技术也将成为微生物检验的重要方法。