基于序列特异扩增区域标记的栗疫菌巢式PCR检测技术

为建立栗疫菌(Cryphonectria parasitica)快速、准确的检测技术,利用随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)对不同来源地的栗疫菌和其他真菌分离物进行PCR扩增,筛选出栗疫菌的RAPD特异片段SCQ494。将特异RAPD片段SCQ494进行分离、回收,与载体pMD19-T载体连接,转化至大肠埃希菌进行培养,对目标片段克隆测序。根据测序结果,用Primer 5.0软件设计了序列特异扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)引物CQ1/CQ2和巢式PCR引物CR1/CR2。利用引物CQ1/CQ2通过常规PCR对不同来源地供试栗疫菌可扩增出1条约1 420bp的条带,对其他供试菌株DNA的PCR产物均无此条带,检测灵敏度为3pg/μL的基因组DNA;而以引物CQ1/CQ2为外圈引物和引物CR1/CR2为内圈引物进行的巢式PCR可从栗疫菌基因组DNA中扩增出1条大小约875bp的条带,灵敏度达到30fg/μL,是常规PCR的1000倍。验证实验表明巢式PCR可以从发病程度不同的栗树枝干和在自然感染的栗树枝条中检测出栗疫菌。

大白菜细胞质雄性不育系RAPD特异扩增片段的克隆及其序列分析

利用RAPD技术从大白菜细胞质雄性不育系CMS3411-7的DNA中得到1个特异扩增片段CMSO-PL01670,进一步以该片段为探针进行Dot和Southern杂交证实了该片段为不育系所特有。回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行序列测定。测序结果表明该片段全长673bp,其碱基组成为A+T=67.16%。通过与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中的455972个序列进行比较,同源性均小于30%,表明该片段为一新发现序列。并且该序列的+4～+216的区域内含有1个可编码70个氨基酸的开放阅读框架。上述结果为今后从分子水平进一步研究大白菜细胞质雄性不育打下了坚实的基础。

川木通的随机扩增多态性DNA与序列特征性扩增区域标记研究

目的采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)法建立川木通的分子鉴定方法,为川木通的快速鉴定奠定基础。方法从100对随机引物中筛选出5对多态性丰富的RAPD引物进行川木通10个种的扩增分析,最终得到C13为阳性序列特征性扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)标记。结果阳性SCAR标记均可以进行川木通原植物与药材的分子鉴定引物,C13可以鉴定上述2种药典品种和商品主流品种(粗齿铁线莲、钝萼铁线莲)。结论 RAPD法简便易行,为亲缘关系较近的多基原药材的鉴定提供了一种新方法。

一株酿酒酵母的特征区域序列扩增标记

以23株不同来源的酿酒酵母为研究对象,分别提取基因组DNA,试用50条随机引物对其进行随机扩增多态性DNA分析,筛选到两条具有菌株鉴别能力的随机引物。P09可以从2.412,ST—01,SK—26,ZD—01四株酿酒酵母基因组DNA中扩增出长度为433bp的Sc—433片断Sc—433;P46可以从2.1882,ST—01,NJ—02三株酿酒酵母基因组DNA中扩增出长度为665bp的Sc—665片断,其中仅有目的菌株ST—01能稳定的扩增出这2个标记。把这2个片断分别克隆到pUCmT质粒载体中,经过酶切鉴定后测序,根据序列设计特异性引物,把RAPD标记转化为特征区域序列扩增标记,为酿酒酵母菌株的分子鉴别提供了新的借鉴。

利用PCR技术体外扩增牛Y染色体特异DNA序列的研究

本实验建立了用ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术体外扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列的方法。根据牛的ＳＲＹ序列设计一对引物，两条引物均为２３ｂｐ，对公牛１９４ｂｐ序列进行体外扩增。从屠宰的公、母牛肝和血液中提取ＤＮＡ，用作ＰＣＲ模板，ＰＣＲ仪内进行扩增。结果表明公牛个体样品显示清晰可见的特异ＤＮＡ扩增带，而母牛个体样品无扩增片段出现，与预期的结果完全符合。

小麦春化相关特异性PCR扩增体系的建立

以小麦幼苗DNA为模板 ,采用小麦春化相关特性Verc2 0 3序列设计合成的春化特异引物 ,进行PCR扩增。通过对扩增体系中引物浓度、Taq酶浓度、Mg2 + 、退火温度以及扩增程序的选择优化 ,确定了PCR扩增的最佳条件 。

胞质雄性不育白菜叶绿体ndhJ-trnF区域序列发生变异

以来自Polima胞质甘蓝型油菜雄性不育源转育获得的不育白菜'Bpol97-05A'和其回交亲本即保持系'Bajh97-01B'为材料,利用cDNA扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)技术获得一条长约330bp的特异片段P1708,RT-PCR验证确认该序列为不育白菜材料所特有,经测序和BLAST比对,发现该片段除54bp的插入序列外,其余部分与大白菜和甘蓝叶绿体ndhJ-trnF基因之间的一段序列完全一致.根据基因区域两端的保守部位设计引物,以Polima不育白菜DNA和可育甘蓝型油菜的DNA为模板,分别获得了长约1900bp的序列,比较序列发现:不育白菜与可育白菜、甘蓝型油菜的DNA序列存在一定差异,'Bpol97-05A'中除多个位点发生变异外,另有108bp的插入序列,该插入由2个长度为54bp的重复序列组成,重复序列中除5′端3个碱基CTT外,其余部分均与trnF基因3′端51bp完全相同.

通过改良RAPD技术获得黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃的3条SCAR新标记

目的寻找快速区分黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃的序列特征扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)新标记。方法在改良的随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)的基础上对10个物种进行基因组DNA随机扩增、分子克隆和测序,分别设计了可鉴别3个物种的SCAR标记。结果成功筛选出3个SCAR标记,其相应的特异性标记分别为N2-12、A2-17和A6-33;其中SCAR标记N2-12在黑毛种属中扩增出约750 bp的特异性条带,SCAR标记A2-17在蜂腰石斛中扩增出约750 bp的特异性条带,SCAR标记A6-33在石仙桃种属中扩增出约600 bp的特异性条带。结论N2-12、A2-17和A6-33这3对特异性SCAR新标记能快速、准确的区分出黑毛石斛、蜂腰石斛和石仙桃这3个物种,为今后进行该中药道地药材样品的鉴定提供了实验依据。

西花蓟马的SCAR分子检测技术

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种世界性入侵害虫,寄主范围广,危害严重,2003年首次在我国发生危害,并有进一步扩散蔓延的趋势。针对蓟马类害虫虫体微小、形态相似,难以准确快速区分的问题,采用特征序列扩增区域(SCAR)标记技术,以西花蓟马及与之同域发生的其他种类蓟马为对象,筛选出1对西花蓟马特异性引物(FOMF/FOMR),其扩增片段大小为320bp。种特异性检测结果显示,该对引物只对西花蓟马的基因组DNA具有扩增能力,对同域发生的花蓟马F.intonsa(Trybom)、禾花蓟马F.tenuicornis(Uzel)、烟蓟马Thripstabaci L.等41种蓟马不具有扩增效果。该对引物不仅对不同虫态的西花蓟马具有扩增能力,而且在西花蓟马发生地的寄主植物组织内亦检测到了其卵的存在。同时,该检测技术灵敏度高,对成虫的最低检出阈值为1/160头。本检测技术在口岸检疫以及花卉、蔬菜和种苗调运中的害虫检测和监测中具有重要意义。

与瓠瓜品系‘J083’白粉病抗性基因连锁的SCAR分子标记

以瓠瓜抗白粉病品系‘J083’和感病品系‘J73’及它们的F1代和F2代分离群体为试验材料,经接种鉴定和抗性遗传规律分析表明:瓠瓜品系‘J083’对白粉病的抗性受单隐性基因控制;从100对扩增片段长度多态性(AFLP)引物组合中获得稳定的多态性引物组合1对,即E-ATG/M-CTC;经回收、测序,特异片段全长为105 bp,并成功将其转化为序列特征性扩增区域(SCAR)标记;经连锁分析,该SCAR标记与白粉病抗性基因的连锁距离为9.6 cM,将其命名为GPDSATG/CTC75.此标记可用于瓠瓜抗白粉病品种的辅助选育.

天敌对烟粉虱捕食作用的SCAR标记检测

以烟粉虱和捕食性天敌为研究对象,采用特征序列扩增区域(SCAR)标记法,通过对目的片段的克隆与测序设计烟粉虱特征片段扩增引物,检验该引物的种、虫态及性别特异性,并利用该引物检测捕食性天敌对棉田烟粉虱的捕食作用。研究结果表明,利用SCAR标记法获得了长度为347bp的烟粉虱特异性片段(GenBank登录号为AY841800),根据此片段的碱基序列设计烟粉虱特异引物1对TB-F/TB-R94585,其扩增片段约为240bp;种特异性检验结果表明,该引物只对烟粉虱具有扩增能力,对温室粉虱及其它相关种类不具有扩增效果;同时该引物对不同虫态、不同性别的烟粉虱具有同样的扩增效应。田间检测结果表明,同种天敌昆虫幼体捕食作用检出率高于成虫;在所检测的4类群9种捕食性天敌中,龟纹瓢虫幼虫、异色瓢虫幼虫、草蛉幼虫及东亚小花蝽成虫和蜘蛛对烟粉虱捕食作用的检出率高于50%。

紫菜自由丝状体SCAR标记的获得

应用RAPD技术对27个紫菜自由丝状体材料进行遗传多样性分析，获得7个紫菜材料的7个特异标记。对这7个特异片段进行了回收、克隆，对其中5个片段已完成了序列测定，根据这5个序列的两端顺序合成了5对SCAR—PCR引物，经过优化PCR反应条件成功地将紫菜材料Porphyra tenuipedalis的RAPD扩增片段OPZ-19140和P．yezoensis qd-8的RAPD扩增片段OPJ-18488转换成两个SCAR标记。因为这两个标记的序列已全部测通，故又称为STS标记。这两个SCAR标记(STS标记)可以作为紫菜P．tenuipedalis和P.yezoensis qd-8自由丝状体材料种质鉴定、优良品系选育和产权保护的分子标记。

航天诱变番茄无限生长突变体RAPD及SCAR分子标记研究

目的通过对航天诱变所获得的番茄无限生长习性突变体进行分子水平的鉴定,为番茄生长习性分子标记选育提供依据。方法用50个10-mer随机护增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)RAPD引物检测M1和10-3-2基因组序列多态性,对多态性片断回收克隆后转化成序列特征性扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)标记。结果50个RAPD引物中有44个引物扩增出产物,其中2个引物(S165和S168)扩增出稳定的重复性好的多态性条带,均表现为M1缺失条带。其特异扩增产物分子量分别为300bp和1500bp,暂命名为TRS165300和TRS1681500,其中TRS1681500标记已经转换成了稳定的SCAR标记,并可作为该突变体的特异遗传标记。结论航天诱变可以从DNA水平对搭载材料进行诱变,通过航天诱变获得的番茄无限生长习性突变体,为研究番茄生长习性调控提供了宝贵的材料。

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。

夏威夷椰子超氧化物歧化酶基因片段的克隆与序列分析

以热带植物夏威夷椰子(Chamaedoreacostricana)基因组DNA为模板,根据SOD基因保守序列设计特异引物进行PCR扩增,得到特异基因片段.回收该基因片段,与pMD182T载体连接,并转化到感受态大肠杆菌ER2566细胞,获得Cu·ZnSOD基因片段的克隆.序列分析表明夏威夷椰子Cu·ZnSOD基因片段含3个外显子和3个内含子,编码64个氨基酸,与玉米、红薯和白杨相应氨基酸序列的同源性分别为82.81%,81.25%,81.25%和79.69%.

卡瓦胡椒SCAR分子标记的研究

目的:采用6份卡瓦胡椒材料、21份栽培胡椒和野生胡椒材料1、份不同属的草胡椒材料共计28份试验材料,开发1对特异SCAR引物。方法:在对它们进行了RAPD研究的基础上,通过克隆、测序和引物设计进行了SCAR分子标记研究。结果:研究开发了1对卡瓦胡椒特异SCAR引物P4.1和P4.2,用这对特异引物对试验的28份材料进行PCR扩增,结果只有6份卡瓦胡椒材料扩增出了预期大小562bp的特异带,其它材料均无任何扩增。结论:这说明引物P4.1和P4.2为卡瓦胡椒特异SCAR引物,可用于卡瓦胡椒的分子鉴定,这对卡瓦胡椒种质资源的真伪鉴定有一定帮助。

与美洲黑杨抗黑斑病基因连锁的SCAR标记的开发

通过测序和引物设计,将与美洲黑杨抗黑斑病基因相连锁的RAPD标记OPAI17-1550和OPAI13-900成功地转化成显性SCAR标记(SAI17-1570)和共显性SCAR标记(SAI13-292),并对感、抗病池和F1代91个无性系进行了SCAR标记检测。SAI17-1570在抗病池和OPAI17-1550阳性的F1代植株中扩增出1条与RAPD扩增结果相符的特异性条带,而在感病池和OPAI17-1550阴性的F1代植株中没有相应的带,SAI13-292在抗病池和OPAI13-900阳性的F1代植株中扩增出2条带,而在感病池和OPAI13-900阴性的F1代植株中只有其中1条带。

烟草SCAR标记技术的建立

目的:通过烟草随机扩增多态性DNA(RAPD)标记技术建立烟草特征序列扩增区域(SCAR)标记技术,用于烟草品种鉴定。方法:对12个烟草品种的复烤叶片DNA进行RAPD分析,得到2个RAPD特异片段S1和S2,通过切胶回收,连接pUCm-T载体克隆转化,片段测序,设计特异性引物S1-1/S1-2和S2-1/S2-2,对SCAR-PCR扩增退火温度进行优化。结果:2个RAPD标记成功地转化为稳定快捷的SCAR标记,可将红花大金元和NC102等2个品种从12个烟草品种中快捷准确地鉴别出来。结论:SCAR标记可作为准确稳定的DNA水平的烟草品种鉴定方法,可对种植、复烤和配方品种的烟叶或叶片进行鉴别。

番茄LE-ACC_2合酶基因5′端前导序列分离方法的研究

通过ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件对 Ｒｏｔｔｍａｎｎ等人发表的番茄 ＬＥ－ＡＣＣ２合酶的 ５’端 ２．０ Ｋｂ的前导序列作分析，设计了４对特异引物；以番茄果实、叶片的总ＤＮＡ为模板，采用特异ＰＣＲ扩增技术获得了 ２．０， １．８７， １．５８， １．２８ Ｋｂ ４个特异片段，用 Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ技术构建了１个克隆（２．０ Ｋｂ）、３个亚克隆（１．８７，１．５８，１．２８ Ｋｂ），对４个克隆产物进行了 ＤＮＡ序列测定，借助 ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件对所获得的各克隆序列进行综合处理与分析，获得了番茄 ＬＥ－ＡＣＣ２ ５’端前导序列的同源率为９９．９％，但第－９７９位的 Ｃ和第－１０７６位的 Ｔ分别为 Ｔ和 Ｃ所替代。对利用 ＰＣＲ技术分离大片段ＤＮＡ的各环节作了较详细的研究。

一种新型的分子标记—SCARs验证王浆高产蜜蜂的RAPD分子标记—W316bp的研究

为了验证王浆高产蜜蜂的RAPD分子标记—W 316bp正确性 ,采用了新型分子标记—SCARs ,研究结果获得的SCARs分子标记与原来RAPD分子标记有一致的显性行为 。