在强背景噪声条件下 M-序列相关技术的应用和采样平均数的选定

研究表明,在应用M-序列相关技术进行声学测量时,通过多次平均的方法可以有效地抑制背景噪声的影响。因而,即使在强背景噪声条件下,使用这种测试技术仍可得到满意的测量精度。本文还给出了确定采样平均数的经验公式。

应用于食品检测领域的分子即时检测技术研究进展

食品安全问题关系人类民生。为有效预防和控制食品安全风险,减少食品安全经济损失,迫切需要开发出针对食源性病原体、食物掺假、转基因作物的高特异性、高敏感性、快速的核酸检测技术。即时检测(point-of-care testing,POCT)作为一种新兴的快速检测手段,由于其检测速度快、操作简单、现场检查等特点,在食品检测领域应用广泛。本文首先介绍了POCT技术的发展历史,而后根据食品安全事件的特点,从食源性致病菌、食物掺假、转基因作物3个方向分析了食品检测的主要对象,阐述了分子POCT技术在食品检测领域的应用现状,最后对应用于食品检测领域的分子POCT技术存在的问题和解决办法进行了分析总结,对食品检测分子POCT技术的发展方向进行了展望。本文有助于进一步了解分子POCT技术在食品检测中的应用,并为分子POCT技术在食品快速检测中的研究和应用提供参考。

基于293T-Cas9细胞株构建ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp病毒

目的构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒。方法利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞,然后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹技术检测Cas9基因及蛋白表达情况;利用分子克隆技术构建HSV-1病毒ICP34.5基因敲除的基因编辑质粒(pU6-Ecfp);pU6-Ecfp转染293T-Cas9细胞后感染野生型HSV-1病毒,在胞内通过CRISPR/Cas9技术敲除HSV-1病毒中ICP34.5基因,再利用增强型青色荧光(Ecfp)示踪及极限稀释法进行病毒富集纯化,通过PCR法进行oHSV-1/Ecfp病毒鉴定。结果PCR扩增、核酸电泳及蛋白质免疫印迹技术结果显示,细胞株293T-Cas9高转录Cas9基因及高表达Cas9蛋白;通过PCR鉴定及荧光示踪结果显示,基因编辑质粒pU6-Ecfp构建成功;Ecfp荧光示踪、PCR扩增及核酸电泳结果显示,Ecfp成功插入ICP34.5基因敲除位点,获得oHSV-1/Ecfp重组病毒。结论稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞可作为CRISPR/Cas9基因编辑的工具细胞,构建的HSV-1/Ecfp病毒实现了ICP34.5基因敲除及Ecfp示踪蛋白的敲入。

CRISPR-Cas9系统抑制乙型肝炎病毒复制相关研究

目的:探讨成簇的、规律间隔的短回文重复序列-相关核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein-9 nuclease,CRISPR-Cas9)技术的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作用。方法:通过生物信息学筛选,获得12条靶向HBV基因组不同区域的sg RNA(single-guide RNA,sg RNA)并分别构建psp Cas9-sg RNA质粒,与HBV1.3倍体复制质粒共转染至Hep G2细胞,通过荧光定量PCR筛选能够有效抑制HBV复制的sg RNA,并使用Southern blot验证获得的sg RNA功能;使用最新报道的重组共价闭合环状DNA(recombinant covalently closed circular DNA,rccc DNA)模型评估CRISPRCas9对HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,ccc DNA)的抑制水平,并通过克隆测序检测rccc DNA的突变状况;对C57小鼠进行尾静脉高压水动力注射(hydrodynamic injection,HDI)rccc DNA质粒与psp Cas9-sg RNA,检测不同时间点外周血中乙型肝炎病毒s抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)及e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBe Ag)水平,通过免疫组化技术观察CRISPR-Cas9处理后肝脏中乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core antigen,HBc Ag)水平,在动物水平评估CRISPR-Cas9对HBV复制的抑制作用。结果:所筛选的靶向乙型肝炎病毒基因组聚合酶编码区以及衣壳蛋白编码区的sg RNA5及sg RNA9能有效抑制细胞中HBV复制,分别使细胞复制模型中rc DNA降低至对照组的(43.64±4.66)%(P=0.000)和(44.86±2.25)%(P=0.000);在r CCCDNA细胞模型中证实2组sg RNA分别使ccc DNA降低至对照组的(29.39±3.18)%(P=0.000)及(26.83±1.76)%(P=0.000);CRISPR-Cas9系统主要使rccc DNA的靶点区域发生以短片段缺失为主的突变,突变率位50%~60%。CRISPR-Cas9系统能够有效降低HBV水动力小鼠模型血清HBs Ag(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.001)及HBe Ag浓度(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.000);小鼠血清HBV DNA水平与对照组相比降低约1个lg值(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.001),肝脏免疫组化结果显示CRISPR-Cas9系统能够降低组织HBc Ag表达。结论:CRISPR-Cas9系统作为一种基因编辑技术,能够在细胞水平及动物模型中发挥抗HBV作用,可以作为一种新型的抗病毒策略并为HBV感染的治疗提供了一个新的方向。

呼吸道感染病原体检测技术与发展趋势

由于传统呼吸道病原体检测手段的限制,导致临床诊断难、治疗用药难。呼吸道感染多联检产品时效性高,可及早识别感染,并指导抗感染药物的合理使用。各种便携式(快速)诊断技术产品发展迅速,临床应用前景广阔。宏基因组二代测序技术(mNGS)对呼吸道感染病原体的检测覆盖面广、信息量大,对呼吸道病原体的早期发现,特别是新发传染病的病原体快速诊断,起到非常重要的作用。基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)的核酸检测技术、三代测序技术及基因芯片技术等快速检测新技术为呼吸道病原体的诊断开辟了新的方向。

基于内转录间隔区和β-微管蛋白部分基因及相关序列扩增多态性分子标记技术推断红曲霉系统发育关系

目的基于内转录间隔区(ITS)、β-微管蛋白(β-tubulin)部分基因和相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术结合形态学鉴定方法 ,推断不同种红曲霉的系统发育关系,寻找快速、准确鉴定红曲霉的方法。方法以红曲霉基因组为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增红曲霉ITS、β-tubulin部分基因,利用Mega 7.0软件中最大似然树法构建进化树,扩增SRAP分子标记技术的特征结合序列,利用R软件phangorn包中的FigTree软件进行建树,使用除权配对(UPGMA)法进行聚类分析,通过分析不同种红曲霉系统发育关系,找寻快速、准确的鉴定方法。结果利用ITS和β-tubulin部分基因可将31株供试菌株分为两大类,而SRAP分子标记技术可将供试菌株分为四大类,结合表型分析和3种分子鉴定方法 ,参照15株红曲霉参考菌株将16株未鉴定到种的红曲霉分别鉴定为安卡红曲霉、橙色红曲霉和紫色红曲霉。结论 SRAP分子标记技术具有更多的分类依据,结合表型分析能够帮助更快、更精确的将红曲霉鉴定到种。

成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性

目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9（BB）-2A-Puro （PX459）质粒构建表达导向RNA（sgRNA）载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应（PCR）和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为（30.67±2.49）%和（88.00±1.63）%（P=0.000），表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为（53.99±1.29）%和（32.42±1.20）%（P=0.000）。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。