香蕉ELF3的克隆与表达分析

【目的】早花基因3(EARLY FLOWERING3,ELF3)是生物钟系统核心振荡器的重要组成成员,在植物生物钟和开花调控及逆境胁迫等过程扮演重要角色。目前尚无香蕉ELF3的相关报道,为揭示ELF3在香蕉抵御逆境胁迫中的功能对其进行了鉴定、克隆和表达分析。【方法】克隆了从香蕉基因组鉴定获得的4个MaELF3成员(MaELF3-1-MaELF3-4),利用生物信息学手段分析了它们的序列特征,基于转录组数据和实时荧光定量PCR研究了它们在高低温胁迫、香蕉枯萎病菌FocTR4侵染及茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)处理后的表达模式。【结果】4个MaELF3的CDS长度介于2 058-2 301 bp,可编码685-766 aa。除MaELF3-4含3个外显子外,其余MaELF3s均含4个外显子。4个MaELF3s均为定位于细胞核的不稳定碱性蛋白;与温带植物ELF3s不同,MaELF3s和多种热带植物的ELF3均无朊病毒样结构域(PrD)。系统进化结果显示,MaELF3-2和MaELF3-4与拟南芥ELF3(At2g25930)亲缘关系最近;MaELF3-1和MaELF3-3分别与粗柄象腿蕉(Ensete ventricosum)和野蕉(Musa balbisiana)ELF3亲缘关系最近。MaELF3s启动子上存在一些光、激素(MeJA、ABA等)和逆境胁迫(干旱、低温等)响应相关元件。基因表达分析结果显示,所有4个MaELF3s在香蕉叶片中的表达均受ABA和JA影响,且它们在香蕉根系中的表达受FocTR4显著抑制;除MaELF3-4外其他成员的表达均受高低温显著抑制。【结论】MaELF3s参与了香蕉对不同逆境胁迫的响应。

棉纤维蔗糖合酶基因SS3上游调控序列的克隆及其表达分析

棉纤维蔗糖合酶基因SS3在棉纤维发育过程中起着重要作用.采用YADE技术克隆了该基因5′上游1717bp的调控区,该调控区含有典型的启动子核心元件TATA box ,以及TATC box、G box、GCN4 -motif、Prolamin box、Skn 1 likemotif、TCA element、HSE和O2 site等各种顺式调控元件和其他一些反应元件.将此序列和报告基因GUS融合在烟草、棉花中表达.组织化学分析结果显示棉花SuSyR序列启动GUS基因在烟草的子房、胎座、种子以及在棉花花蕾与棉铃中表达.在棉花花蕾蕾长为3mm、6mm、9mm和15mm花蕾中表达主要存在于雄蕊及雄蕊管、胎座等器官;在棉铃中,1DPA棉铃的花柱、花药、子房及胚珠中出现了蓝色,6DPA棉铃的子房及胚珠被染成蓝色,在2 0DPA的棉铃中蓝色只出现在胚珠及其纤维中、在胚珠中只有珠心被染成蓝色,在4 0DPA胚珠中只有纤维呈蓝色.研究结果揭示,棉花的SuSyR调控序列启动GUS基因主要在子房、胚珠和纤维等器官和主叶脉、茎微管束等输导组织中表达,在棉花中尤为明显,表明棉纤维蔗糖合酶基因SS3除参与棉花蕾铃发育、纤维素的合成外,还参与了光合产物的运输与分配过程.

基因表达序列分析技术(SAGE)在家蚕研究中的应用现状与前景

家蚕是鳞翅目模式昆虫,家蚕组数据库和基因表达差异分析数据库的建设为鳞翅目害虫功能基因的研究提供了一个便利的技术平台。基因表达序列分析技术(SAGE)以及在此基础上发展起来的结合标签的基因序列延伸(GLGI)、长片段基因表达序列分析(LongSAGE)等在家蚕获取基因表达谱、发现组织特异表达以及发现新基因中应用获得了很多重要的结果;众多通用SAGE数据库以及家蚕数据库为SAGE数据的生物信息学分析提供条件;以SAGR为核心的一系列技术通过定性与定量研究将把家蚕基因研究引入基因网络研究中,进行靶向定位以及辐射研究,加快家蚕后基因组时代步伐,为快速有效地发掘和研究鳞翅目害虫的功能基因提供模式价值。

长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)表达序列标记分析

分别采用BlastX和Blast2go软件对453条非冗余的长心卡帕藻EST序列进行匹配分析和GO注释。结果表明,有281条序列与蛋白数据库中序列匹配,有132条序列被归属为3个子本体:分子功能、生物学过程和细胞组成。同时筛选到24个与逆境适应相关的基因,包括应对胁迫反应和抗氧化反应的基因。采用GCUA软件,进行长心卡帕藻基因密码子偏倚性的研究。结果表明其密码子偏倚性与其它红藻差别较大,平均G+C含量和密码子的第三位的G+C含量均较其它藻类偏低。上述工作为进一步研究长心卡帕藻基因及其功能奠定了基础。

球毛壳菌(Chaetomium globosum)过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白(pero)基因片段(GenBank Accn: BP099709)为基础,用RACE技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3’ RACE产物和508bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17．5kDa,理论等电点为5．75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA 序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明:该基因与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高(83％)。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG 诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kDa处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符, 说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在 GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。

基于RNA-seq对南蛇藤MADS-box转录因子序列及表达分析

为了分析南蛇藤MADS-box转录因子对其雌花发育和果实形成的调控信息,本文基于南蛇藤的转录组数据,获得15个具有全长开放阅读框的MADS-box转录因子(Col MADS),并利用生物信息学方法对其性质和结构特性进行了分析。结果表明,基因comp37814_g1和comp41380_g2属于M-type家族,不含有K盒结构,其他均为MIKC家族;除了comp37713_g1之外,其余均属于不稳定的亲水性蛋白;二级结构均含有α-螺旋、扩展链结构、β-转角和无规则卷曲,其中α-螺旋所占比例最高;序列主要包含5种保守基序,基序1和基序2分别含50个氨基酸且属于该基因家族的保守基序,仅基序1含有MADS盒。系统进化分析结果显示南蛇藤Col MADS转录因子被分为10个进化支,分属于不同类型的亚家族及不同的组。另外,利用荧光定量PCR检测方法揭示了这些基因在南蛇藤盛花、落花和幼果不同发育时期的表达情况。结果表明,2个基因在盛花期相对表达值最高,9个基因在落花期相对表达值最高,在幼果形成过程中有4个基因显著上调表达。

巨峰葡萄Rs基因的克隆鉴定、序列分析与时空表达特征研究

探究白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,Rs)在巨峰葡萄果实发育中的潜在作用。对其序列进行结构及功能分析,并鉴定其在果实不同发育时期的时空表达特异性。采用生物信息学分析及qRT-PCR的方法,对巨峰葡萄Rs基因序列进行分析,并对其结构和亚细胞定位进行预测,以及分析果实不同时期不同组织的表达情况。克隆得到的Rs基因cDNA全长1539bp,开放阅读框(ORF)为1179bp,编码392个氨基酸,预测蛋白分子质量42.88ku,理论等电点(pI)为6.09,且该基因含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位点以及完整的芪合酶家族特征位点;蛋白互作预测发现,Rs和OMT2.1具有互作,后者可催化白藜芦醇生物合成紫檀芪;亚细胞预测结果表明,Rs基因主要在细胞质和叶绿体中表达;启动子分析发现,Rs基因表达可能受光照、MYB、真菌和激素的调控并存在一定的组织特异性。qRT-PCR表达分析显示,葡萄Rs基因在果皮和果肉中不同时期均有表达,但在花后25d的青皮中表达量最高。结合Rs基因在白藜芦醇积累的作用,可以推测可能在果实发育前期的果皮中白藜芦醇有较高积累。巨峰葡萄Rs基因在进化过程中具有较高的保守性,其表达可能受环境、真菌和激素的调控且与OMT2.1具有互作效应。而且在不同的组织和时期存在一定的特异性。

平邑甜茶新根扩展蛋白基因MhEXP1的cDNA全序列克隆及表达

【目的】对平邑甜茶[Malus hupehensis (Pamp) Rehd.var pinyiensis Jiang]新根扩展蛋白基因进行克隆和表达分析,为揭示扩展蛋白在平邑甜茶根系生长发育中的功能打下基础。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术克隆扩展蛋白同源基因,并通过Northern杂交研究其在不同器官中的表达情况及吲哚丁酸(IBA)的处理效应。【结果】成功地从平邑甜茶白色新根中获得了一个全长的扩展蛋白基因,命名为MhEXP1,GenBank登录号为DQ538346。MhEXP1 cDNA全长1111bp,含有771bp的完整开放阅读框,编码257个氨基酸,预测分子量和等电点分别为27.8kD和8.9。序列分析表明,MhEXP1具有扩展蛋白的典型结构,即氨基酸序列N端有8个半胱氨酸残基,1个组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)域,C末端存在4个保守的色氨酸残基。Northern杂交表明,该基因在平邑甜茶叶片中表达量很低,但在新根中大量表达并受IBA诱导,且随着IBA处理时间的延长表达量逐渐增加。【结论】成功地从平邑甜茶中克隆了一个全长的扩展蛋白基因MhEXP1,该基因在叶片中表达量很低但在新根中大量表达,并受IBA诱导;MhEXP1参与IBA调节的平邑甜茶根系生长发育。

表达基因分析方法

了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段,不同生理状态下的基因表达状况,可以为研究生命活动过程提供重要的信息。表达基因分析方法不断完善,包括抑制消减杂交技术,基因表达序列分析,基因表达谱芯片,电子克隆等。作者主要介绍了这些技术的原理、方法、特点及其应用情况。

利用SAGE方法分析家蚕基因表达数目的初探

SAGE(serial analysis of gene expression)是基因表达水平差异分析和大规模发现新基因的分子生物学技术。已构建了家蚕卵、幼虫、蛹、成虫等4个不同发育时期的SAGE表达库,经测序分别得到69 100、62 232、63 966和62 666个基因标签序列,其中特异标签数目依次为17 718、13 243、14 044和15 224。这些特异标签数目即为家蚕在这4个不同发育时期的基因转录本数量。根据测序数与获得标签的数量动态监测,发现测序的数目尚未达到饱和,因此基因转录本的数目还可能会有所增加。在上述研究的基础上,利用SAGE数据为基础,采用双倒数作图求最大值的方法,推测出了家蚕在4个不同发育时期的基因表达数目,同时也发现家蚕卵期的基因表达数目远远大于其它3个时期。

硝酸菌norB基因的克隆及序列分析

目的扩增、克隆硝酸菌的norB基因。方法通过PCR扩增硝酸菌的norB基因,然后克隆至T载体中,并转化进E.coliJM109中。通过兰白斑挑选阳性转化子。对质粒测序,并与Genbank上的序列进行同源性分析。结果同源性搜索发现所有扩增到的基因无论在核酸序列水平还是在蛋白序列水平都与Genbank上的汉堡硝化杆菌norB基因同源,且同源性高达96%～98%。结论扩增获得的基因经过基因序列分析证实为硝酸菌norB基因。

基因表达系列分析技术在真菌功能基因组学中的应用

基因表达系列分析(SAGE)是一种在mRNA水平上高通量、快速、灵敏分析细胞或组织基因表达信息,并在基因组学研究中广泛应用的技术。该技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞表达的基因,比较不同时空条件下基因表达的差异,还可以在全基因组范围内获得基因的表达谱,从而发现新基因。综述基因表达系列分析技术在材料用量、标签长度、技术流程和标签测序等方面的研究进展及该技术在病原真菌、工业真菌和食用真菌功能基因组学中的应用。

类大麦属高分子量谷蛋白基因Kx的序列测定及表达

利用SDS_PAGE检测了2份类大麦属(Crithopsisdelileana)材料的高分子量谷蛋白亚基组成,并对其中1份材料的x型亚基进行了克隆和测序。结果表明,2份材料具有完全相同的蛋白电泳图谱。在小麦的高分子量区域仅检测到一条蛋白质带,与小麦y型亚基的迁移率接近,但克隆测序表明其为x型高分子量谷蛋白亚基,其编码基因命名为Kx。Kx基因编码区序列长度为2 0 5 2bp ,编码长度为6 6 1个氨基酸残基的蛋白质,其序列具有典型的x型高分子量谷蛋白亚基的特征。Kx基因能在原核表达系统内正确表达,其表达蛋白与来源于种子中的Kx亚基的迁移率完全一致。Kx亚基与小麦属A、B和D ,山羊草属C和U以及黑麦属R染色体组编码的高分子量谷蛋白亚基氨基酸序列非常相似,但在N和C保守区的氨基酸组成以及重复区长度上与它们存在明显差异。聚类分析可将Kx与Ax1聚类为平行的分支。由此可见,来源于C .delileana的Kx基因为一新的x型高分子量谷蛋白亚基基因。

瓜叶菊Mlo基因的克隆、分析及VIGS载体构建

试验以瓜叶菊(Pericallis hybrida B.Nord.)为试验材料,采用RT-PCR和RACE方法获得白粉菌调控相关Mlo基因的cDNA全长序列,通过VIGS技术构建载体,进行基因沉默并转入到农杆菌GV3101中。序列分析表明,该基因cDNA全长包含1个1 296 bp的开放阅读框,编码431个氨基酸。荧光定量结果表明,Mlo基因在瓜叶菊的根、茎、叶中都有表达,叶片中表达量最高,根中表达量最低。根据PCR结果和双酶切鉴定结果表明载体构建成功。通过PCR结果显示载体已成功转入农杆菌GV3101中。该研究为下一步分析基因沉默后瓜叶菊中Mlo基因变化提供依据。

基因表达研究新方法SAGE和GLGI及其在家蚕功能基因组研究中的应用前景

基因表达序列分析技术 (serialanalysisofgeneexpression ,SAGE)是用于基因表达水平差异性分析和大规模发现新基因的重要分子生物学技术 ,该技术能反映生物个体在不同的发育时期或生理状态下的基因表达全貌 ,在家蚕功能基因组研究中运用该技术有助于找到一些新基因 ,甚至发现一些涉及发育变态、性别调控和蚕丝产量、质量性状的相关基因。结合标签的基因序列延伸 (generationoflongercDNAfragmentsfromSAGEtagsforgeneidentifica tion ,GLGI)是将从SAGE中得到的 10bp的标签tag经过PCR转化成数百碱基对的 3′EST序列 ,大大增加了tag的特异性。GLGI还有助于充分利用那些没有和GenBank数据库匹配的tag ,因而具有重要的应用价值。

表达谱基因芯片筛选子宫内膜异位症相关基因及IL-12受体在子宫内膜异位症中的作用

目的探讨子宫内膜异位症(EM)患者的发病机制和白细胞介素12(IL12)及其受体(IL12R)的水平与疾病进展的关系。方法应用578点的人类免疫相关表达谱cDNA基因芯片筛选EM相关基因。酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定21例EM患者及21例对照者血清中IL12水平。结果(1)用Array3000扫描仪扫描芯片,观察杂交结果,用ImaGene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。在对6张芯片的结果分析中,获得EM的相关差异基因9个,共同表现为上调的基因2个,下调的基因7个。其中下调基因中差异最显著的是IL12R;(2)ELISA检测结果显示EM组与对照组患者血清中IL12水平无明显差异;EM患者血清IL12水平与疾病期别无明显相关;两组患者血清IL12水平与月经周期亦无明显相关。结论基因芯片技术是一种有效的、高敏感、高通量的技术。EM患者的异位内膜组织的IL12RmRNA水平表现为下调,表明它可能在此疾病的发生与发展中起重要作用。

亚麻抗白粉病基因SAGE分析

基因表达系列分析可使细胞中全部表达基因实现定性与定量,是一种高通量的研究真核细胞表达基因信息的检测技术。试验采用具有更高特异性的I-SAGETM LONG KIT,以亚麻抗白粉病品系9801-1及其感病对照黑亚11号为材料,将转录体系中的各转录本以一个特异的寡核苷酸序列(SAGE标签)为代表,从cDNA中分离出这些标签制备成一个数量大约在20000个SAGE的标签库,进一步连接成标签多聚体用于克隆测序,数据可以与SAGE map(www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE)、SAGE Genie(cgap.nci.nih.gov/SAGE)参考数据库相比较,以备现在和将来的分析使用。

应用表达谱基因芯片筛选子宫内膜异位症相关差异基因

目的 :研究子宫内膜异位症患者 (EMs)与非子宫内膜异位症 (非EMs)患者在位子宫内膜基因表达的差异 ,从分子水平探讨子宫内膜异位症的发病机制。方法 :选用含有 14 112位点的人类表达谱cDNA基因芯片 ,筛选EMs患者与非EMs患者不同月经周期在位子宫内膜的差异表达基因。结果 :筛选出增生期差异基因 193个 ,其中上调 5 8个 ,下调 135个 ;分泌期差异基因 93个 ,其中上调 6个 ,下调 87个 ;增生期和分泌期共同差异基因 2 0个 ,其中上调 1个 ,下调 19个。结论 :用表达谱基因芯片可有效地研究EMs患者与非EMs患者不同月经周期在位子宫内膜基因表达的差异 ,通过进一步分析有望筛选出与EMs相关的新基因靶点。

胃癌中管家基因表达的恒定性研究

目的观察胃癌中管家基因的表达是否恒定。方法通过分析胃癌基因表达序列分析数据库(SAGE),观察胃癌中管家基因的表达是否恒定。同时运用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)分别测定胃癌组织、正常组织中管家基因GAPDH、β-actin mRNA的表达情况,并进行半定量灰度分析,对结果进行验证。结果通过分析胃癌SAGE数据库中管家基因的拷贝数,发现在不同病变组织以及病变组织与正常组织间多数管家基因的表达是不恒定的。GAPDH、β-ac-tin在胃癌中的表达发生明显改变,与正常组织比较,差别均有统计学意义(P<0.01)。结论胃癌中管家基因表达的不恒定性普遍存在。由于管家基因在胃癌中的表达不恒定,在运用RT-PCR技术对胃癌基因表达进行定量分析时,应选择适当的2种或2种以上的内参基因,以减少检测标本间的差异。

金鱼蛋白磷酸酶2A-B″家族Alpha和Gamma调节基因的cDNA克隆及mRNA表达

以金鱼卵巢组织作为材料,运用RT—PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基B″家族中γ基因(G5PR)cDNA全序列和α基因(PR130)cDNA部分序列.结果显示γ基因cDNA全长1885bp,编码一个含457个氨基酸的蛋白质.而α基因cDNA长1781bp,编码的多肽共含426个氨基酸,系α亚基的部分蛋白序列.它们与已知其他物种对应的B″家族蛋白质均有着很高的同源性.结构预测分析发现,α和γ两条多肽均存在PP2A调节亚基B″家族成员共有的两个EF-HAND结构域.用RT-PCR的方法检测了这两个基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平.结果表明,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中最为丰富.与γ亚基表达模式相比,α亚基表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最低,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强.据此,推测α、γ两调节亚基可能在金鱼不同组织和胚胎发育过程中起着特定的作用.此外,进一步的分析发现,α基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的功能.