ARMS法与Sanger测序法检测结肠癌KRAS基因突变的对比

目的:对比分析突变扩增阻滞系统法(ARMS)及Sanger测序法对结肠癌患者KRAS基因突变的检测效果。方法:收集2019年3月—2023年4月医院收诊的98例结肠癌手术患者,并对其手术切除病理标本中KRAS基因突变情况进行探究,每个标本均同时展开ARMS法、Sanger测序法检测,深入对比分析两种检测结果。结果:98个病理标准中ARMS法检测出40例KRAS基因突变(40.82%),Sanger测序法检出39例KRAS基因突变(39.80%),两种方法均检出1例有GGT>GAT(G12D)和GGC>GAC(G13D)双突变(P>0.05);ARMS法与Sanger测序法检测结果与年龄、性别无明显关联(P>0.05);两种方法检测KRAS基因突变具有明显一致性,其Kappa系数=0.578(P=0.001)。结论:在直肠癌KRAS基因突变检查中,ARMS法与Sanger测序法均有明显的优缺点,相比于金标准Sanger测序检查,ARMS法的临床实用价值更高,可进一步解决其检测局限性,以提高检出率。

应用宏基因组二代测序法评价支气管镜消毒灭菌效果的初步研究

目的评估宏基因组二代测序法在检测支气管镜消毒灭菌效果中的价值。方法对内镜室经过氧乙酸高水平消毒灭菌的8根支气管镜,采用50 mL含相应中和剂的无菌液以冲洗、刷洗两种方法先后留取16份样本。采用常规法进行微生物培养,同时将支气管镜的冲洗液(C1~C4、C5~C8)和刷洗液(S1~S4、S5~S8)混成4份样本,采用宏基因组二代测序法进行检测,观察上述两种检测方法下的检测结果。结果16份样本经常规方法培养2 d、7 d后均未检出病原微生物。4份混合样本宏基因组二代测序法检出少量序列的抗辐射不动杆菌、铜绿假单胞菌、腐生葡萄球菌、豚鼠气单胞菌、金黄色葡萄球菌、逊德勒不动杆菌、卡他莫拉菌、巴斯德葡萄球菌等常见背景菌,未见特殊或难培养的微生物;2份冲洗液和对应的刷洗液在检出微生物种类、序列数上无明显差异。结论微生物培养法能够满足当前支气管镜消毒灭菌效果评价的需求,宏基因组二代测序法具有更高的敏感性,但成本偏高而不适合常规采用。

转座酶可及性染色质测序法联合RNA测序探究解旋酶样转录因子基因的缺失对肝细胞癌的影响

目的:探究解旋酶样转录因子(helicase like transcription factor,HLTF)基因在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中潜在的调控机制。方法:构建HLTF基因稳定敲除的HCC细胞株。应用RNA测序法(RNA sequencing,RNA-seq)检测并分析肝癌细胞HLTF基因敲除前后的差异表达基因。应用转座酶可及性染色质测序法(assay for transposase-accessible chromatin using sequencing,ATAC-seq)检测HLTF基因敲除前后肝癌细胞染色质可及性的改变。采用RNA-seq和ATAC-seq多组学数据进行联合分析,寻找HLTF基因潜在的下游调控通路和关键基因。结果:癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库分析表明HLTF基因在HCC组织中的表达水平升高,且其高表达与HCC预后不良有关联;RNA-seq分析结果显示,与野生型肝癌细胞相比,HLTF基因敲除细胞中有563个基因的表达水平上调,656个基因的表达水平下调;ATAC-seq分析结果显示,共27818个区域在HLTF基因缺失时染色质可及性发生显著改变,其中14225个区域染色质可及性增强,13593个区域染色质可及性减弱;对染色质可及性改变的区域进行motif富集分析,数据显示在染色质可及性增强的区域,Atf3、Fra1和BATF等被富集,在染色质可及性减弱的区域,Fra1、Fra2和JunB等被富集;RNA-seq和ATAC-seq多组学数据联合分析表明,重叠基因主要富集在花生四烯酸代谢通路、Wnt信号通路、钙离子信号通路和转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)信号通路等。HLTF基因的缺失使核RNA输出因子3(nuclear RNA export factor 3,NXF3)基因表达水平升高。NXF3基因高表达的HCC患者的预后较NXF3基因低表达的HCC患者好。结论:在HCC中,HLTF基因可能参与调控花生四烯酸代谢通路、Wnt信号通路和TGF-β信号通路等,NXF3基因可能是HLTF基因的潜在下游基因。

直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性检测中的比较

目的：了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性（SNP）检测上的差别。方法：对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应（PCR）扩增，分别对其产物进行直接测序和克隆测序。结果：在样本的检测中，PCR产物直接测序法所测序列与43～60bp以后克隆测序相同；检出一个突变位点并与GenBank（DQ012938）发表序列一致。结论：PCR产物直接测序法和克隆测序法都是检测SNP的有效方法，但前者不仅特异性强，敏感度高，而且比克隆测序方法更为快速简便，节省材料。

实时荧光定量PCR和测序法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的比较

背景与目的以厄洛替尼(Erlotinib)为代表的小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂在治疗非小细胞肺癌已经取得很好的疗效。许多研究发现表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变与酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。本研究目的是通过比较荧光定量PCR(Real-time PCR)和DNA测序法检测EGFR基因突变的一致性,建立适用于临床的EGFR基因突变检测方法。方法应用荧光定量PCR(Real-time PCR)及DNA测序法检测103例非小细胞肺癌标本的EGFR外显子19和21的基因突变,结果比较采用卡方检验。结果两种方法对EGFR外显子19和21的基因突变的检测结果无统计学差异,且荧光定量PCR法比测序法更快捷和灵敏。结论与测序法相比,荧光定量PCR更适用于临床检测。

卷烟感官质量评价信息的优序法分析

在建立评价指标体系的基础上 ,利用优序法对卷烟感官质量的评价信息进行分析。与现行评分法相比 ,优序法能较大程度地消除评吸人员的影响 ,更客观地反映卷烟内在质量的优劣。该方法既能处理定量问题 ,又能处理定性问题 ,且应用简单 。

焦测序法检测禽流感病毒

以焦测序技术为检测平台,在研究禽流感病毒基因特性的基础上,建立一种检测禽流感病毒及确定其是否为高致病性禽流感病毒的序列测定法。首先,选择一段保守的M基因序列及一段包含裂解位点的HA基因序列为研究对象,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增技术初步判断其是否为禽流感病毒及病毒亚型;然后采用焦测序法检测目的片段序列;最后,对焦测序法检测序列进行分析,从基因序列上判断其是否为禽流感病毒,并进一步判断病毒的亚型以及是否为高致病性禽流感病毒。研究结果表明,当焦测序反应中三磷酸酰苷双磷酸酶(Apyrase)的浓度为1.6U/mL时,能有效抑制错误信号的产生;当Klenow的浓度为90U/mL时,可读序列长度为33个碱基。采用优化的焦测序反应体系测定了4个样本,其中1个样本被判断为H5N1亚型禽流感病毒,具有潜在的高致病性;另外3个样本为H9N2型禽流感病毒,具有低致病性。本方法具有准确、快速和实时检测等优点。

焦磷酸测序法在HBV阿德福韦酯耐药检测中的应用

目的评价焦磷酸测序法在慢性乙型肝炎(CHB)患者阿德福韦酯(ADV)耐药检测中的应用。方法选取ADV治疗失败的CHB患者,采用PCR产物焦磷酸测序法检测ADV耐药相关的rtA181V/T和rtN236T变异,并与PCR产物双脱氧测序法进行比较。计算两种方法的耐药检出率及采用焦磷酸测序法检出的变异株在病毒群中所占的比例。结果共入选患者210例,经双脱氧测序法与焦磷酸测序法检测共确认耐药变异患者67例,耐药变异位点92个,其中焦磷酸测序法检出耐药患者64例(95.52%)、变异位点86个(93.48%),双脱氧测序法检出耐药患者52例(77.61%)、变异位点71个(77.17%),两种方法结果符合率为83.8%。焦磷酸测序法检出44例发生单位点变异的患者,其中变异株比例<50%的患者26例,最低耐药株比例为6.5%。rtA181T、rtA181V、rtN236T变异的平均变异株比例分别为34.12%、61.23%、59.69%,其中rtA181V与rtN236T的变异株比例无明显差异(P=0.909),但均高于rtA181T的变异株比例(P<0.01,P<0.05)。结论焦磷酸测序法的ADV耐药检出率优于双脱氧测序法,前者可进一步计算患者体内变异株的比例;在大部分患者中检出耐药时变异株不一定是优势株。

重亚硫酸氢盐测序法检测Wnt信号通路抑制基因在急性早幼粒细胞白血病细胞中甲基化变化

目的:应用重亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4)Wnt信号通路抑制基因启动子区CPG岛的甲基化状态,筛选NB4细胞中高甲基化的Wnt信号通路抑制基因,并探讨BSP法作为定量研究基因甲基化方法的优缺点。方法:以NB4细胞为研究对象,20例健康人单个核细胞为对照;常规提取DNA并用亚硫酸氢盐处理,然后用PCR扩增目标序列,应用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析在NB4细胞中Wnt信号通路抑制基因基因的甲基化状态。并通过与甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,M SP)、焦磷酸测序技术(pyrosequencing)比较、评价BSP法检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化状态的优缺点。结果:BSP产物克隆测序检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因95.26%,DKK3基因86%,SFRP1基因81.67%,SFRP2基因95.71%,SFRP4基因85%,SFRP5基因95%;20例健康人单个核细胞为对照组中Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因1.5%,DKK3基因4.2%,SFRP1基因0%,SFRP2基因0.9%,SFRP4基因2.5%,SFRP5基因1.75%。与正常人M NC相比,NB4细胞的Wnt信号通路相关抑制基因启动子甲基化率明显增高。结论:急性早幼粒细胞株NB4细胞中存在Wnt信号通路多个抑制基因高甲基化状态。此类基因异常甲基化有可能成为急性早幼粒细胞白血病的早期诊断指标和治疗靶点。

直接测序法与ARMS法检测甲状腺乳头状微小癌组织中BRAF基因突变的比较

目的:探讨直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions amplification refractory mutation system,scorpions ARMS法)检测甲状腺乳头状微小癌组织中(Papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)的鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因突变的特异性和敏感性。方法:采用直接测序法和ARMS法同时检测56例甲状腺乳头状微小癌患者组织中BRAF基因突变情况。结果:56例患者甲状腺癌组织中,直接测序法与ARMS法所检出BRAF基因突变阳性率分别为32.1%和82.9%,敏感度分别为39.1%和100%,前者均显著低于后者(P<0.01)。结论:检测甲状腺乳头状微小癌组织BRAF基因突变时ARMS方法较直接测序法具有更好的敏感性,癌组织小的标本BRAF基因突变检测更适合用ARMS法。

亚硫酸氢钠测序法检测水稻FIE基因CpG岛甲基化状态

建立了适用于水稻基因组特定基因甲基化检测的亚硫酸氢钠测序法,并利用此方法对FIE2A基因CpG岛部分片段的甲基化差异进行了研究。采用CTAB法提取水稻叶片和胚乳细胞的基因组DNA,经亚硫酸氢钠化学修饰后,针对已修饰的FIE基因序列设计特异引物并结合巢式PCR扩增,TA载体克隆、测序,最后对测序结果进行分析。结果表明巢式PCR能够增加特异性产物的产生,FIE基因CpG岛在对称的CG和CNG位点甲基化水平较高,而在非对称CNN位点甲基化水平最低,此外在叶片中的平均甲基化水平较高。由此表明本研究建立的亚硫酸氢钠测序法适用于水稻基因组特定基因甲基化状态的检测。

优序法在软件质量评价中的应用

优序法是一种用于评价的较好方法，目前已在管理成果评价等方面得到了应用，该方法同样适用于软件质量评价。该方法应用简单，既能处理定性问题，又能处理定量问题。文章给出了优序法在软件质量评价中的应用。

下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学建立及性能评价

目的建立乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法,并对此方法进行性能评价。方法采用离心柱法提取血清标本中的DNA,设计引物对乙型肝炎病毒P基因区扩增并靶向捕获,通过下一代测序技术对捕获的DNA进行检测,利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析,得到基因突变结果,建立下一代测序用于乙型肝炎病毒YMDD突变的检测方法。收集慢性乙型肝炎患者血清样本共229例,采用下一代测序法和Sanger测序法同时检测YMDD基因突变,评价下一代测序法的检测性能。选取5例基因突变阳性的样本(包含不同基因突变型别)、2例基因突变阴性样本,采用下一代测序法对所选样本进行重复检测,评价该方法的重复性。结果建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序检测方法。对229份临床样本的检测中,2种测序方法均检测到74例(74/229,32.31%)YMDD突变,其中下一代测序法检测到44例(44/229,19.21%)rtM204V突变,25例(25/229,10.92%)rtM204I突变,5例(5/229,2.18%)rtM204V/I混合突变。Sanger测序法检测到47例(47/229,20.52%)rtM204V突变、25例(25/229,10.92%)rtM204I突变和2例(2/229,0.87%)rtM204V/I混合突变。下一代测序法检测到3例Sanger测序法漏检的rtM204V/I混合突变。与Sanger测序法相比,下一代测序法的灵敏度、特异度和准确度均为100%,突变类别完全符合率为95.95%(71/74),部分符合率为4.05%(3/74)。2种方法的一致性(κ)为0.97(P<0.01)。经重复性试验检测,下一代测序法的检测结果均一致,重复性符合率为100%。结论本研究建立的乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法灵敏度高,特异性好,重复性好,准确性高,比Sanger测序法更灵敏,能检测到更多的混合突变,为乙型肝炎病毒耐药基因检测提供了新的手段。

直接测序法和ARMS法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变的比较

背景与目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为靶点治疗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是现在治疗肺癌的前沿手段,因此检测EGFR是否突变成为治疗肺癌的关键一步。本研究旨在探讨直接测序法和ARMS法检测NSCLC患者的EGFR基因突变情况及检出率。方法收集自2012年4月-2013年6月本中心接受进行EGFR基因突变检测的NSCLC患者,分别用直接测序法和ARMS法对这些患者的肿瘤组织标本进行检测,检测其中EGFR基因第18-21外显子的突变情况,并比较两者方法的优劣。结果在该451例两种方法均检测的患者中,两种方法均检测到突变且突变结果一致者127例,结果不一致者5例,均无突变者186例,直接测序法检测到突变而ARMS法未检测到突变者50例,反之83例。50例中有33例为ARMS法29种突变之外的突变。直接测序法检测的突变率为40.4%,ARMS法检测的突变率为47.7%,ARMS法的突变检出率明显高于直接测序法(P<0.001)。在204例石蜡组织中,ARMS法的突变检出率59.80%明显高于直接测序法41.67%(P<0.001);而在240例新鲜组织中,两种方法无统计学差异(P=0.083)。结论直接测序法和ARMS法检测EGFR基因突变基本一致,ARMS法更为灵敏,且操作方便快捷,但是价格昂贵。对于肿瘤组织含量较少的样本中,ARMS法更为敏感,明显优于直接测序法。直接测序法可以检测到ARMS试剂盒内不包含的少见突变。结合两种方法检测结果更为可靠全面。

以测序法为准比较HRM法、ADx-ARMS法和TaqMan探针法检测肺腺癌EGFR基因突变的敏感性

目的采用高分辨率熔解曲线法(HRM法)、Adx-ARMS法、Taq Man探针法和直接测序法检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体基因(EGFR)的突变情况,并比较各方法的检测效率和敏感性。方法收集20例肺腺癌石蜡包埋肿瘤组织,其中18例为手术切除标本,2例为穿刺小标本,应用HRM法、ARMS法和Taq Man探针法分别检测EGFR基因突变,对检测结果不一致的样本采用测序法加以验证。结果 20例肺腺癌组织样本中,HRM法、ARMS法和Taq Man法分别在13例、10例和8例组织中检测到EGFR基因突变,差异不显著(P>0.05)。差异标本经测序验证后发现,HRM法可检测未知突变,而ARMS法和Taq Man探针法只能检测已知突变。对于2例穿刺小标本,HRM法和ARMS法均检测到突变,而Taq Man探针法未检测出突变,HRM法和ARMs法的检测敏感性高于Taq Man探针法。结论 HRM法、ARMS法、Taq Man探针法和测序法各有优缺点,HRM法敏感性最高,且能检测到少见突变与未知突变,因此HRM法结合测序法能更全面的检测出各种突变类型。

基于物体空间序法的CT图像三维重建算法的研究

首先对三维可视化方法进行了分类概述。接着对基本的物体空间序法及其改进算法———抛雪球法做了详细的描述 ,并且通过对两组CT数据进行三维重建实验 ,得到高质量的重构图像。最后 ,本文研究并采用了提取表面体素进行体绘制加速的方法 ,实现了基于等值面提取表面的加速算法 。

MassARRAY定量分析法与普通亚硫酸盐测序法检测心肌梗死大鼠模型低甲基化基因序列的效果比较

目的通过比较MassARRAY定量分析法与普通亚硫酸盐测序法(BSP)检测心肌梗死大鼠乙醛脱氢酶(ALDH2)基因启动子甲基化的效果,为确定适用于低甲基化基因序列检测的最佳方法提供依据。方法取10只平均体重为(200±10)g的雄性Sprague-Dawley大鼠,将其随机分入对照组和实验组,每组5只。实验组行心脏冠状动脉左前降支结扎术,制备心肌梗死模型。常规饲养7d后,取实验组大鼠心脏梗死边缘区心肌组织,同时在对照组的相同区域取材。提取边缘区心肌组织DNA,分别采用MassARRAY定量分析法和普通BSP检测两组大鼠ALDH2基因核心启动子上游同一段DNA序列甲基化情况。结果 BSP可检测显示目标区域12个CpG位点,但检测结果示对照组和实验组均无DNA甲基化发生;MassARRAY定量分析法可检测显示目标区域10个CpG位点(2号至11号位点),实验组和对照组10个CpG位点均有低度DNA甲基化(<30%),且两组间5号、6号和7号CpG位点甲基化水平的差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论对于低甲基化基因序列,MassARRAY定量分析法较BSP拥有更好的DNA甲基化检测精度和检测效率。

亚硫酸氢盐-基因组测序法在检测基因异常甲基化中的应用

目的:介绍一种准确、敏感的检测多个标本、多个CG二核苷酸甲基化状态的方法。即亚硫酸氢盐-基因组测序法(BisulfiteGenomicSequencing,BGS)。方法:单链DNA的胞嘧啶可被亚硫酸氢盐修饰转变成尿嘧啶,而5'甲基胞嘧啶仍保持不变。这种修饰处理可在甲基化和非甲基化基因组DNA间产生DNA序列差异,而这种DNA序列差异可通过BGS法较为灵敏地筛查出。利用该原理检测肝癌细胞AFP基因启动子区CG二核苷酸甲基化状态。结果:在癌细胞中发现两种异常甲基化,即高度甲基化及部分甲基化。结论:BGS法在基因甲基化检测中将有很大的应用潜能,为探讨肿瘤发生机制提供了新的分子分析方向。

科技编辑的检序法^+

检序法是在大量编辑实践的基础上,归结出的一种实用的编辑方法。作者给出科技文稿中的序的定义与分类,结合实例讨论不同类型序的特点与检查方法,应用并对检序法在科技编辑工作中的作用作了简要评述。

PCR产物直接测序法检测乙肝病毒耐药位点的临床研究

目的总结核苷(酸)类药物[nucleos(t)ide analogue,NA]长期治疗应答不佳患者的临床特征,便于在耐药检测前或不具备耐药检测条件时对患者的耐药情况进行初步判断,指导治疗。方法使用直接测序法对89例NA相关耐药的慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)患者进行检测,分析其耐药变异位点,总结耐药患者的临床特征。结果 89例长期使用NA治疗应答不佳的CHB患者的耐药位点检测阳性率明显高于未用药的对照组(44.9%vs.6.7%,P<0.001)。拉米夫定(lamivudine,LAM)耐药相关病例的耐药位点检测阳性率为45.0%。阿德福韦酯(ade-fovirdipivoxil,ADV)耐药相关病例的耐药位点检测阳性率为20.0%。ADV相关耐药位点检测阳性组应用ADV的疗程明显长于阴性组[(23.82±14.13)个月vs.(7.79±11.74)个月,P<0.001]。发生病毒学突破(或反弹)组耐药位点检测阳性率明显高于原发无应答组(58.33%vs.29.27%,P=0.006)。LAM治疗失败ADV再治疗患者比ADV初治者耐药检出率高,具有显著性差异(42.86%vs.11.54%,P=0.010)。多药组的耐药检出率明显高于单药组(62.75%vs.21.05%,P<0.001),且多位点联合耐药检出率高(P=0.004)。结论长期NA治疗应答不佳患者耐药人群的临床特征是:多药使用者、病毒学突破(或反弹)者、长疗程ADV用药者。了解这些高危人群的特点对于在耐药检测前或不具备耐药检测条件时对患者的耐药情况进行初步判断,进而挽救治疗具有指导意义。