库德毕赤酵母原生质体制备与再生

库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)对木质纤维素稀酸水解物3大代表性毒物——脂肪酸、呋喃及酚类化合物均有优良的降解活性,是纤维水解物耐毒发酵菌种改造重要的基因组资源。文章研究了库德毕赤酵母原生质体制备、再生的影响因素,确定了适宜的原生质体制备条件,旨在为通过基因组改组策略构建耐毒发酵菌株奠定基础。结果表明:选择对数生长中期的细胞,以0.8 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂,0.1%ED-TA-Na2+0.3%β-巯基乙醇预处理30 min,用3.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶在30℃下酶解2.5 h,其原生质体达到61%,原生质体再生率达到32%;毒物会强烈抑制原生质体再生,不宜直接以毒物作为再生前融合子的检出标记。

果香风味导向的库德毕赤酵母FJZ的分离鉴定及生物学特性研究

通过嗅闻试验从清香型白酒新鲜酒醅中筛选到一株产生浓郁苹果清香风味的菌株,通过HS-SPME-GC-MS分析发现该菌株在小米固体培养基中能产生大量的乙酸乙酯,占风味物质的37.71%。通过菌落菌体观察、生理生化及分子生物学试验,确定该菌株属于毕赤酵母属的库德毕赤酵母,命名为库德毕赤酵母FJZ。对菌株FJZ的生物学特性研究表明,该菌株对环境具有一定的耐受性,可在pH 1.5~10.5、乙醇体积分数0%~14%、葡萄糖质量分数10%~60%、温度28~42℃条件下生长,最适生长的葡萄糖质量分数为20%、乙醇体积分数为6%。

山羊乳-FOS/GOS库德毕赤酵母DS8-1微胶囊的制备及体外评价

前期从新疆传统乳制品酸驼乳中筛选得到一株具有潜在益生特性的库德毕赤酵母DS8-1(Pichia kudriavzevii DS8-1),为增加菌株对体外环境的抗性,以海藻酸钠为壁材使用锐孔法制备酵母菌微胶囊。将干燥的藻酸盐(SA)微胶囊外包山羊乳或在微胶囊壁材中添加低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)/低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)分别制备3种酵母菌微胶囊:SAM微胶囊、SAMF微胶囊和SAMG微胶囊。对微胶囊进行傅里叶红外光谱和扫描电子显微镜表征、模拟胃液的耐受性、消化液的释放特性和贮藏稳定性实验,研究冻干微胶囊对菌株活性的影响。结果表明:使用羊乳包衣的3种冻干微胶囊(SAM微胶囊、SAMF微胶囊和SAMG微胶囊)的菌株活力为7.16~7.67(lg(CFU/g))。与SA微胶囊相比,SAMF微胶囊在连续的模拟消化液处理后能够延缓酵母菌的释放,提高菌株存活率,以及对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制活性。SAMG微胶囊在-20、4、25℃贮藏30 d后菌株活力在7(lg(CFU/g))以上。结论:在海藻酸钠中添加FOS/GOS且使用羊乳包衣可用于包埋库德毕赤酵母,制备的酵母菌微胶囊具有提高菌株活性的作用,在功能性食品输送体系中具有一定的应用前景。

基于TMT的定量蛋白质组学技术解析盐胁迫提高库德毕赤酵母耐热性机制

利用串联质谱标签定量蛋白质组学技术,分析单独热胁迫组和热-盐共胁迫组之间的蛋白质组差异,筛选与耐热性提高相关的关键蛋白。结果发现,热休克蛋白12以及麦角固醇生物合成蛋白(ergosterol biosynthetic protein,ERG)28、ERG25等麦角固醇合成相关酶的表达在盐胁迫后显著增加,有利于维持热胁迫下细胞内蛋白质和细胞膜结构和功能的稳定。盐胁迫显著提高谷胱甘肽S-转移酶Y-2基因的表达,对抑制热诱导的脂质和蛋白质氧化损伤有重要作用。同时,盐胁迫显著提高热胁迫下碳水化合物代谢和能量代谢通路中多种酶(己糖激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶1、磷酸甘油酸变位酶2、磷酸甘油酸激酶、乙醇脱氢酶、细胞色素c氧化酶亚基6A、V型质子ATP酶亚基c’)的表达,有利于细胞内ATP合成和酵母菌耐热性的提高。本研究结果为耐热酵母菌的基因工程改造以及其高温乙醇发酵能力的改善提供重要技术支撑。

基于非靶向代谢组学研究砷酸盐胁迫下库德毕赤酵母代谢物的变化

砷酸盐[arsenate,As(Ⅴ)]作为水体中砷的主要存在形态之一,通过食物链影响食品安全。微生物砷脱除技术以其安全经济的优势成为解决食品砷污染途径之一。对砷的脱除能力是微生物脱砷技术的前提和基础。库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)作为一种多抗性酵母,可耐盐、高温和重金属(镉、锌和铜)等。该文研究了As(Ⅴ)对P.kudriavzevii A16生长的影响,并运用非靶向代谢组学技术研究了砷酸盐胁迫与正常培养条件下P.kudriavzevii A16之间的差异表达代谢物及代谢通路的变化。砷酸盐胁迫与正常培养相比,正离子模式下检测到317个差异代谢物,169个显著上调表达,148个代谢物显著下调表达;负离子模式下,检测到差异代谢物329个,其中171个显著上调表达,158个代谢物显著下调表达;差异代谢物的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集通路主要涉及谷胱甘肽代谢、氨酰tRNA合成等代谢通路,As(Ⅴ)促进了酵母细胞能量代谢,增强了其抗氧化性能。该文从代谢组学水平解析了砷酸盐胁迫下库德毕赤酵母代谢物的变化,为指导微生物法脱砷技术的开发提供参考。

库德毕赤酵母FJZ固态发酵产乙酸乙酯工艺的优化

基于风味导向技术从山西传统清香型白酒酒醅中分离获得1株能赋予白酒清香风格且高产乙酸乙酯的库德毕赤酵母FJZ。采用固态发酵技术,以乙酸乙酯和总酯含量为检测指标,通过单因素及响应面试验优化发酵工艺,确定库德毕赤酵母FJZ固态发酵产乙酸乙酯发酵工艺条件为:发酵温度30℃,发酵时间7 d,接种比例3%,辅料添加量4%,该条件下高粱固态发酵醅中的总酯含量为(8.13±0.08)g/100 g,乙酸乙酯含量为(1.30±0.014)g/kg。以上研究为该菌株在清香型白酒生产中的开发应用奠定了基础。

基于培养基优化提高过表达MET14基因的重组库德毕赤酵母M48脱镉能力的研究

对一株具有高镉抗性和镉脱除率的过表达MET14基因的重组库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) M48进行培养基优化研究,以其脱镉率和生物量的综合值为评价指标,通过单因素实验、25-1部分析因设计和中心组合设计优化培养基成分,为后期将重组菌株M48做成脱镉制剂提供研究基础。结果表明,最优培养基成分为:葡萄糖23.42 g/L,酵母浸粉27.72 g/L,磷酸二氢钾2.04 g/L。在此条件下得到的M48脱镉率为79.63%,生物量为9.95 g/L,分别是未优化前的2.70倍和1.16倍。本研究通过优化重组菌株M48的培养基成分,有效提高了其脱镉率和生物量。

逆境对GST基因过表达库德毕赤酵母G43生长及脱镉能力的影响

目的探究逆境对谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因过表达库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)G43生长及脱镉能力的影响。方法以一株高镉抗性和高镉脱除率的GST基因过表达的重组P.kudriavzevii G43为研究对象,从生物量和脱镉率两方面评价盐、低pH、乙醇及高温逆境条件对其生长和脱镉能力的影响。结果逆境培养条件对G43的生长和脱镉能力影响较大。与原始菌株P.kudriavzevii A16(CK)相比,G43对盐、酸、乙醇及热的耐受力均有显著提升:可耐受质量浓度为120 g/L的NaCl,pH 2.5时仍可正常生长,培养基乙醇体积分数10%时仍可生长,可耐受43℃高温。在不同逆境条件下,G43的脱镉能力与原始菌株相当或者有明显提升。结论重组菌株G43具有优异的耐受性,不同培养条件对其脱镉效果有很大影响,此为后续P.kudriavzevii等微生物的镉抗性和脱镉机制研究提供基础数据,也为其在食品体系镉脱除领域的应用奠定理论基础。

猕猴桃汁中酵母菌的分离鉴定及应用

该研究采用传统培养分离方法从自然发酵的猕猴桃汁中分离筛选酵母菌,并通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行菌种鉴定。采用该菌株发酵猕猴桃-苹果梨复合果酒,并以酒精度及感官评分为响应值,通过单因素试验及响应面试验优化发酵工艺。结果表明,从猕猴桃汁自然发酵液中分离筛选出一株酵母菌株AY1-1,经鉴定为库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii),其发酵猕猴桃-苹果梨复合果酒的最优发酵工艺为:发酵温度21℃、AY1-1接种量0.4%、初始糖度20.8%、猕猴桃果汁与苹果梨果汁质量比1.6∶1.0,在此发酵工艺条件下,猕猴桃-苹果梨复合果酒色泽淡黄,澄清透明,酒味纯正,有明显的猕猴桃和苹果梨复合果香,口感细腻,复合果味与酒味协调,感官评分为(91.3±0.1)分,酒精度为(11.5±0.1)%vol,总酸含量为4.9 g/L,总糖含量为3.7 g/L,未检出沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及其他致病菌,其理化及微生物指标符合相关国标要求。

耐高温酵母的筛选鉴定及发酵性能的初步研究

为获得耐高温酵母菌,从白酒糟醅中分离筛选出1株在45℃生长良好且产乙醇能力较高的酵母菌株。经ITS和26S rDNAD1/D2区域序列分析比对,结合菌落菌体形态鉴定其为库德毕赤酵母。其最适生长温度为30℃,与安琪酵母相比较,高温条件下生长优势明显。以浓度为10%(w/v)的葡萄糖为底物,在45℃进行静置发酵,其产乙醇浓度为18.74g/L,安琪酵母产乙醇浓度为11.40g/L,该菌株较安琪酵母表现出明显的优势。

混菌发酵桑葚果酒工艺优化及其特性分析

为探究混菌发酵桑葚果酒的酿造工艺,通过单因素试验探究菌株、接种时间、接种体积比、发酵时间和发酵温度对桑葚果酒品质的影响,并以单因素试验为基础,设计响应面优化试验。结果表明,库德毕赤酵母K1最适与酿酒酵母配伍发酵。混菌发酵桑葚果酒的最优工艺:库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)提前于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)24 h接入,发酵温度26℃、发酵时间14.5 d、酿酒酵母与库德毕赤酵母接种体积比为2.0∶1。在该条件下,发酵得到的桑葚果酒酒精度为8.53%vol,感官评分为90.10。利用顶空固相微萃取-气质联用法(headspace solidphase microextraction-mass spectrometry coupled with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对混菌发酵的桑葚果酒和单菌发酵的桑葚果酒的挥发性香气成分进行解析,共检出27种挥发性香气物质。相较于单菌发酵的桑葚果酒,混菌发酵的桑葚果酒中酯类物质的种类和含量明显增加。

甘蔗糖蜜总糖中提高蔗糖纯度的菌株分离鉴定及生物纯化性能

从甘蔗糖厂周边环境采集污泥、土壤及污水样品,通过甘蔗糖蜜纯化发酵试验筛选提高甘蔗糖蜜总糖中蔗糖纯度的菌株,并对菌株进行形态观察、生理生化特征比较和26SrDNA基因序列同源性分析鉴定。结果筛选获得1株提高甘蔗糖蜜总糖中蔗糖纯度的菌株m-6。菌株m-6纯化发酵10h,甘蔗糖蜜中葡萄糖、果糖的去除比例分别为96.5%、100%,蔗糖在糖蜜总糖中的纯度由初始的55.6%提高至85.7%,菌株m-6对甘蔗糖蜜有良好生物纯化作用。菌株m-6属于库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。

鱼露中组胺降解菌的分离筛选及耐受性

生物胺(biogenic amines)在某些食品尤其是发酵食品中广泛存在,具有一定的食用安全隐患。为获得用于鱼露等发酵食品的生物胺降解菌,从天然发酵鱼露中采用双层显色培养基法初步筛选出不产生物胺的菌株,再用高效液相色谱(HPLC)法进行复筛,得到一株具有高效组胺降解能力的菌株MZ5。经鉴定该菌株为库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii),该菌株在组胺质量浓度10~200 mg/L、乙醇体积分数0~5%、pH 5~7、NaCl质量浓度0~8 g/dL范围内均表现出较高的组胺降解活性。当初始组胺质量浓度为50 mg/L,pH为7时,组胺降解率高达98.61%。菌株Pichia kudriavzevii对乙醇、pH、盐具有较好的耐受性,可作为发酵制剂,该研究结果为开发发酵食品生物胺降解剂提供理论基础。

酿酒功能菌的基因组测序及基因功能注释

为挖掘库德毕赤酵母FJZ在清香型白酒酿造过程中的代谢机制,基于Illumina Novaseq和PacBio测序平台对菌株FJZ进行基因组测序,将测序数据在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库进行比对,并通过GO、KOG和KEGG数据库进行基因功能注释。CAZy分析表明:菌株FJZ具有催化酚类化合物转化合成芳香化合物的香草醇氧化酶(VAO)活性,具有羧酸酯酶催化合成和分解乙酸乙酯、乳酸乙酯的能力,具有甘露糖转移酶催化甘露糖转移到底物生成多萜寡糖的前体的能力等。在GO数据库共注释分子功能类别的基因6320个,具有转移烷基或芳基、糖基、酰基等与酯合成相关的转移酶活性。在KEGG的7类功能数据库中共注释基因7815个,其中代谢相关的基因有1406个,萜类和聚酮类物质代谢相关的基因30个。在KOG共注释到基因3704个,辅酶运输和代谢相关的基因83个等。本研究为清香型白酒酿造过程中酶系的研究,以及白酒风味物质形成机理和酒醅功能菌结构探索提供参考依据。