HSPA13在ARPE19细胞氧化应激中的作用

目的探讨HSPA13在ARPE19细胞氧化应激中的作用。方法采用CCK8法检测不同浓度H2O2对ARPE19细胞活力的影响;Western印迹法和免疫荧光检测H2O2对HSPA13表达的影响;CCK8法检测HSPA13的表达水平对氧化应激诱导的细胞活力的影响;过表达或siRNA干扰HSPA13后,分别检测氧化应激相关指标和促炎因子的分泌;RNA测序分析空载组和HSPA13干扰组差异表达的基因,并进行GO富集及KEGG信号通路分析。结果CCK8法结果显示,与H2O2空白对照组相比,100、200、300、400μmol/L H2O2处理组细胞活力降低(P<0.05)。Western印迹法结果显示,与H2O2空白对照组相比,H2O2处理组HSPA13的表达上升(P<0.05)。CCK8法结果显示,过表达HSPA13可保护细胞活力。氧化应激相关指标和促炎因子检测结果显示,与H2O2处理组相比,过表达HSPA13加H2O2处理组中SOD1和GPX1 mRNA表达上升,MDA含量降低,GSH含量上升,IL-8、IL-2和IL-1β分泌下降;而siRNA干扰HSPA13加H2O2处理组的结果则相反,并且活性氧类含量上升(P<0.05)。RNA测序结果显示,与空载组相比,HSPA13干扰组差异基因表达上调的有64个,下调的有254个。GO富集分析表明,HSPA13与细胞代谢或多种生理过程相关。KEGG分析显示,HSPA13与PI3K-Akt信号通路、TGFβ信号通路相关。结论氧化应激诱导ARPE19细胞中HSPA13的表达上调;HSPA13在细胞氧化损伤中发挥保护作用,这为寻找年龄相关性黄斑变性新的治疗靶点提供有益的线索。

STCH对多巴胺能神经元保护作用的初步研究

本文通过不同手段探讨了STCH(stress and chaperone)对多巴胺能神经元的作用。采用RT-PCR检测STCH的组织表达模式;采用免疫-激光捕获显微切割技术获得单一多巴胺能神经元,采用RT-PCR检测STCH在中脑不同亚区多巴胺能神经元的表达差异;分别构建STCH过表达pEGFP-N2载体和pSuper-EGFP干扰载体,转染HEK293和SH-SY5Y细胞株,检测细胞对MPP+毒性的反应。结果显示:STCH在海马表达最低,肝脏最高;在中央灰质区的多巴胺能神经元可检测到表达,在黑质区检测不到;将STCH干扰片段转染至HEK293细胞,细胞死亡明显;转染至SH-SY5Y细胞,对细胞生长无明显影响,但细胞形态发生改变;与对照组相比过表达STCH的SH-SY5Y细胞对MPP+毒性有抵抗作用,并能抑制MPP+处理细胞中caspase-12的表达。这些结果提示:STCH对多巴胺能神经元具有潜在的保护作用,其机制可能是通过抑制内质网应激诱导的凋亡途径而实现。该结果为寻找Parkinson病的治疗靶向提供了有益的线索。

STCH减弱Aβ_(25-35)对SH-SY5Y培养细胞神经毒性作用的初步研究

目的:研究应激和分子伴侣蛋白(stress and chaperon,STCH)拮抗β淀粉样蛋白(beta-amyloid25-35,Aβ25-35)在体外对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y毒性的机制。方法:用Aβ25-35(20μmol/L)在不同时间点分别处理SH-SY5Y培养细胞,然后采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印记(Western Blot)法检测内质网应激相关分子的表达和c-Jun amino-terminal kinase(JNK)的磷酸化,并采用负载钙荧光探针(acetoxymethyl ester ofFura-2,Fura-2AM)钙成像技术检测过表达STCH对100nmol/L星孢霉素(staurosporin)引起的钙超载的情况。结果:Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞后引起STCHmRNA表达上调,在3h开始升高,12h达到高峰,然后下降;而葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein94,Grp94)则于处理后6h表达上调,9h达到高峰,然后快速下降。Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞能够激活JNK通路,致其磷酸化增加,过表达STCH,能够抑制JNK的磷酸化。过表达的STCH能够显著拮抗stauroposrine引起的游离钙增加。结论:STCH可能通过拮抗游离钙增加,抑制JNK通路而发挥保护神经元的作用,这将为我们寻找神经保护的策略提供有益的线索。