低氧胁迫和恢复对长吻鮠脑组织低氧应答基因、生理生化指标和食欲的影响

为了解长吻鮠脑组织应对低氧胁迫的调控机制,实验运用酶活性测定、H.E染色、qRT-PCR和TUNEL检测等方法,分析比较了低氧胁迫[(0.8±0.1)mg/L]0、2、4、6 h(标示为H0、H2、H4和H6)和恢复[(7.3±0.5)mg/L]2、4、6 h(标示为R2、R4和R6)下长吻鮠脑组织低氧应答基因、生理生化指标和食欲基因的变化。结果显示,在低氧胁迫和恢复下,长吻鮠脑组织氧传感蛋白相关基因(HIFs、PHDs和Vhl)表达量整体呈现出先上升后下降趋势;呼吸代谢酶(HK、PK和LDH)活性在H0时显著升高,SDH和MDH活性在H6时显著降低,恢复溶解氧后,代谢模式由无氧呼吸逐渐转变为有氧呼吸;抗氧化酶(GSH-Px、CAT和SOD)和应激指标(MDA和LPO)在低氧2 h后逐渐升高,恢复溶解氧后氧化应激现象仍然存在。观察脑组织形态发现,在低氧胁迫下长吻鮠脑组织出现了神经细胞肿胀、空泡等受损现象,恢复溶解氧6 h后脑组织受损并未得到有效改善。随着低氧时间延长,脑组织细胞凋亡程度不断增加,凋亡相关基因(Bax、Caspase-3和p53)表达量显著升高,而Bcl-2基因表达量降低,恢复溶解氧后较对照组仍有显著差异。另外,在低氧胁迫0 h和2 h时,长吻鮠摄食率分别下降54%和98%,检测到低氧胁迫能显著抑制促食基因(NPY)和诱导抑食基因(PYY、CCK和NUCB2)表达。研究表明,低氧胁迫和恢复对长吻鮠脑组织氧传感蛋白、呼吸代谢、氧化应激、结构形态、细胞凋亡以及食欲等指标均具有显著影响。本研究结果为阐明低氧胁迫和恢复下长吻鮠脑组织分子调控机制提供一定的理论依据,对今后开展该鱼集约化健康养殖和耐低氧新品种选育工作具有指导意义。

补体应答基因32在小鼠部分肝切除后肝再生过程中的表达及意义

目的 探讨补体应答基因32(RGC32)在部分肝切除(PH)术后肝再生过程中的表达及作用。方法 42只10周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组[切除小鼠完整的肝脏称重、拍照作为正常对照(sham组),进一步切除肝左叶和肝中叶后称重、拍照作为手术对照(0 d组),sham组和0 d组共用一组小鼠]、术后1天组(1 d)、术后2天组(2 d)、术后4天组(4 d)、术后6天组(6 d)、术后8天组(8 d)和术后10天组(10 d),每组6只;PH术建模成功后分别于术后1、2、4、6、8、10天处死小鼠,收集小鼠肝脏,检测肝脏大小变化。HE和油红O染色评估肝组织形态学变化,血清ALT、AST检测评价肝功能变化,免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki67表达并分析肝再生过程中细胞增殖变化,实时荧光定量PCR和免疫组化染色技术检测肝再生过程中RGC32的表达及其亚细胞分布。Ed U细胞增殖实验分析L02细胞过表达或者敲除RGC32对肝细胞增殖的影响。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;两组间比较采用成组t检验。相关性分析采用Pearson相关分析法。结果 PH术后肝脏逐渐增大,第0~6天为肝体比(肝脏质量/体质量)上升的高峰期,不同时间点比较差异均有统计学意义(P值均<0.05);第6~10天肝脏大小变化不明显。PH术后肝脏脂滴显著增多,随着肝再生,脂滴减少,且呈现门静脉区和中央静脉区差异化(P值均<0.05)。与sham组比较,PH术后1天,血清ALT、AST水平明显升高(P值均<0.05),随后分别于术后第6天和术后第2天恢复至sham组水平(P值均>0.05)。免疫组化染色结果显示,PH术后PCNA和Ki67阳性肝实质细胞数迅速增多,第2天数目最多,分别为86±5和89±5,随后逐渐减少;而PCNA和Ki67阳性非实质细胞数逐渐增多,第6天才达到高峰,分别为34±5和25±3,随后逐渐减少。PH术后总RGC32表达在第2天升到最高,随后逐渐降低,细胞质RGC32表达变化趋势与之一致;而细胞核RGC32的表达在PH术后第2天降到最低,随后逐渐升高。相关性分析显示,细胞核RGC32的表达与肝实质细胞的增殖呈负相关(R2=0.308 3,P=0.016 7),细胞质RGC32的表达与肝实质细胞的增殖呈正相关(R2=0.808 6,P<0.000 1)。细胞实验显示,与对照组相比,RGC32过表达EdU阳性率减少15.6%(P<0.01),敲低RGC32表达EdU阳性率增加19.2%(P<0.01)。结论 肝实质细胞和非实质细胞增殖不同步,共同参与了肝脏再生。肝切除术后肝再生过程中,RGC32表达存在核质分布差异,核RGC32对肝细胞增殖具有抑制作用。

肺间质纤维化大鼠肺泡巨噬细胞STAT_1的活化及其依赖性免疫应答基因ICAM-1的表达

目的:探讨肺泡巨噬细胞(AM)中STAT1(signal transducersand activators of transcription 1)的活化在大鼠肺间质纤维化中的作用。方法:50只健康雌性Wistar大鼠随机分成博莱霉素(BLM)组和生理盐水(NS)组各25只,气管内分别灌注BLM和NS。用Western-blot法测定AM中STAT1活化的动态变化;用免疫组化染色法测定AM的ICAM-1(intercellular adhesionmolecule-1)的表达。结果:NS组中的AM内只有少许STAT1活化,气管内灌注BLM后1d,AM中STAT1的活化即开始显著增高,于第7天达高峰,以后逐渐下降,但28 d后仍高于NS组(P<0.05)。NS与BLM组的AM中表达ICAM-1的细胞数增高的模式,与AM中STAT1活化的模式相同。AM中STAT1活化的程度与AM中ICAM-1的表达呈正相关(r=0.913,P<0.01),而后者又与肺组织炎症的积分呈正相关(r=0.947,P<0.01)。结论:实验性肺间质纤维化大鼠AM中存在STAT1的异常活化,并参与了肺泡炎和肺纤维化的形成。

用mRNA差别显示方法分析黑麦盐胁迫下应答基因cDNA片段的表达特性

利用 m RNA差别显示方法分析经 2 5 0 mmol/ L Na Cl处理 3d的黑麦幼苗 ,14个差异 c DNA片段 ,包括 8个诱导表达片段 ,2个增强表达片段和 4个抑制表达片段被检测到。 Northern Blot分析证实 ,其中 0 .8kb、 0 .65 kb和 0 .35 kb c DNA片段有强烈阳性信号 ,命名为 SI80 0 、SI650 、SI350 (SaltInduced80 0 bp、 65 0 bp、 35 0 bp) ,证明与盐胁迫有关。以 SI80 0 为探针与分别经盐胁迫 3d、 7d、 14d的黑麦幼苗总体 RNA杂交 。

干扰素α应答基因的克隆及在兔早期胚胎发育中功能分析

干扰素(interferon,IFN)在哺乳动物早期胚胎发育过程中具有重要的生理功能,但是其作用机制尚不清楚.通过筛选卵巢cDNA文库和5′-RACE方法,克隆了兔卵巢干扰素α应答基因(interferonresponsivegene,IFRG)的全长cDNA(登录号:AJ584672).利用RT-PCR证明IFRG在兔卵母细胞和植入前胚胎中均有表达,这将为深入研究IFN在早期胚胎中的作用机制提供理论参考,卵巢原位杂交表明IFRG在成熟卵泡(类型5)的颗粒细胞中有表达,在初级和次级卵泡的膜鞘细胞和粒层细胞中有很高的表达,鉴于这些细胞与卵泡的发育密切相关,推测IFRG在卵泡的发育、成熟和排卵中发挥重要作用.

转化生长因子β1通过Smad3调控补体应答基因32转录的分子机制

目的:前期工作发现补体应答基因32(RGC-32)是转化生长因子β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中Smad信号下游的关键调控分子。本研究拟进一步明确TGF-β诱导肾小管EMT过程中RGC-32的转录调控机制。方法:体外培养NRK-52E细胞,利用荧光素酶报告基因实验检测RGC-32启动子活性以确定Smad结合元件(SBE)是否为TGF-β诱导的RGC-32转录调控位点;通过凝胶迁移率实验(EMSA)明确与之结合的转录调控分子。结果:(1)转染野生型SBE片段的NRK-52E细胞荧光素酶活性明显增高,而转染突变的SBE片段的细胞无此表现,表明SBE是调控TGF-β诱导的RGC-32转录启动的关键位点。(2)合成32P标记的包含SBE的寡核苷酸探针行EMSA可见TGF-β诱导的核蛋白与探针复合物生成,且加入包含SBE序列的竞争片段可以抑制此核蛋白-探针复合物的形成,表明有蛋白与SBE结合并调控RGC-32的转录。(3)当加入不同的Smad抗体行超迁移实验发现Smad2和Smad3抗体可以和复合物相互作用,表明Smad2和Smad3可能是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分。(4)将Smad2和Smad3分别与p-1500RGCluc共同转染NRK-52E细胞,Smad3可以显著增加RGC-32启动子活性,表明Smad3是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分,而不是Smad2。结论:在TGF-β诱导肾小管EMT过程中,Smad3通过与RGC-32启动子区SBE结合,从而调控肾小管EMT过程。

家蚕中肠组织感染质型多角体病毒的应答基因分析

【目的】筛选家蚕(Bombyx mori)中肠感染质型多角体病毒的应答基因,为阐明家蚕感染质型多角体病的分子机制奠定基础。【方法】应用含有约23 000个家蚕基因组寡核苷酸芯片比较分析感染家蚕质型多角体病毒24、48及72 h的中肠试验组与中肠对照组的差异表达基因;结合生物信息学工具对差异表达基因的功能注释、分类及涉及的信号通路等进行分析;应用实时荧光定量PCR验证17个基因的差异表达。【结果】在感染24、48及72 h后,分别得到了9、51及258个差异表达基因。KEGG通路分析表明,在感染48及72 h后,大多数涉及到代谢通路的基因的表达水平下调,所有涉及到核糖体通路和蛋白酶体通路的基因的表达水平上调。一些免疫相关基因如丝氨酸蛋白酶抑制剂、脂酶、热激蛋白、细胞色素P450、核糖体P0蛋白等基因的表达水平上调。【结论】经荧光定量PCR验证的差异表达基因可能与家蚕感染质型多角体病毒的应答机制相关,研究结果为从分子水平上阐明家蚕感染质型多角体病毒的致病机理提供了新的研究方向。

从环境应答基因多态性探讨体质成因与疾病易感性

结合《内经》中的相关理论,简述了先天禀赋、地理环境、生活习惯等对体质和疾病易感性的影响,并试图分析环境应答基因及其多态性与先天禀赋、地理环境、生活习惯等因素间的相互关系。认为环境应答基因多态性有望成为今后研究体质和疾病易感性的切入点。

脱落酸应答基因的结构、表达调控及信号转导

许多脱落酸应答的基因已被克隆，并已研究了一些基因的调控。其启动子有G－box和ABARE顺式元件。ABARE与Leuzippier（亮氨酸拉链蛋白）互相作用，ABA与某些基因产物结合以及蛋白质磷酸化在基因表达调控中起重要作用。ABA涉及的信号转导是多途径或单途径的。文中讨论了ABA应答基因的结构、表达调控及信号转导的研究方向。

雄激素应答基因与前列腺癌

雄激素是保持前列腺结构与功能完整的重要因素,也是前列腺癌发生的起始要素。因此,以雄激素应答基因为线索,研究前列腺中雄激素的作用不但有助于前列腺癌的发生与转归机制的阐明,也能为前列腺癌的预防与治疗提供新的思路。

植物体细胞胚胎发生及其相关应答基因的研究进展

体细胞胚胎发生途径不仅是植物大规模克隆繁殖的重要途径,也是研究从单细胞到整体植株发育全过程的理想试验体系。植物体细胞胚胎发生的研究已经取得了很大的进展,但是也依然存在许多问题。根据近年来的相关研究报道,简述植物体细胞胚胎发生及此过程中相关应答基因的研究概况,探讨植物体细胞胚胎发生的生理生化基础,并对今后应该加强研究的关键问题提出了自己的看法。

脱落酸应答基因的表达调控及其与逆境胁迫的关系

本文对生长调节物质脱落酸应答基因的类型、结构和功能特征、表达调控的分子机理，以及近年来的热点问题：ＡＢＡ在逆境胁迫反应中的作用机制，ＡＢＡ应答基因与逆境胁迫的关系等作了较全面的综述。

口腔白斑病癌变相关缺氧应答基因和微小RNA的芯片检测及表达验证

目的探讨口腔白斑病癌变进程中的缺氧应答基因及相关微小RNA(miRNA)的表达。方法利用Affymetrix GeneChip人转录组芯片(HTA)2.0对正常口腔黏膜、低危白斑、高危白斑、口腔早期鳞癌进行转录组学检测,基因本体论(GO)功能分析筛选出生物学作用为缺氧应答的基因和相关miRNA,并采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测验证白斑缺氧应答基因和miRNA的表达。结果正常黏膜与低危白斑间有7个缺氧应答差异基因,低危白斑与高危白斑间有10个缺氧应答差异基因,高危白斑与早期鳞癌间有21个缺氧应答差异基因。缺氧应答关键基因低氧诱导因子1α、趋化因子配体2、基质金属蛋白酶3的mRNA和miR-21在正常黏膜、口腔白斑和早期鳞癌中的表达量均呈阶梯式升高,白斑与早期鳞癌之间的表达差异均具有统计学意义,这与转录组芯片结果基本一致。结论缺氧应答基因及相关miRNA参与白斑病癌变。

马铃薯病毒诱导应答基因抑制消减杂交文库构建及分析

马铃薯病毒积累引起的种薯退化是马铃薯生产中造成产量和品质下降的重要原因之一。本研究以马铃薯病毒病携带植株叶片c DNA为试验组(Tester)、脱毒种苗叶片c DNA为驱动组(Driver),采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建了马铃薯病毒诱导应答基因的c DNA文库;为验证文库构建效果,从文库中随机挑取了98个阳性克隆经PCR验证后测序,获得了45条高质量的有效非重复序列;经与Gen Bank进行同源比对后发现,其中14条非重复序列属于马铃薯病毒基因序列,22条与已知基因序列同源性较高,9条无同源参考基因;选取文库中出现频率较高的2个ESTs(expressed sequence tag,表达序列标签)用qRT-PCR技术分析发现,其表达量受马铃薯病毒侵染的诱导。结果表明,该SSH文库构建较为成功,为进一步筛选与马铃薯病毒致病、防御相关的应答基因,解析马铃薯与病毒互作的分子机理,利用生物技术手段培育抗病毒马铃薯奠定了基础。

氟斑牙儿童环境应答基因的筛选

目的利用基因芯片技术筛选氟斑牙人群环境应答基因,为氟中毒分子发病机制的进一步研究提供线索。方法利用Affymetrix公司生产的HG-U133A基因芯片分别检测对照组、高氟负荷组(高氟地区无氟斑牙人群)、氟斑牙患者组的白细胞基因表达谱,并利用生物信息学方法对检测结果进行分析。结果高氟负荷组与对照组比较,差异表达基因有1057个,其中显著上调的基因有148个,显著下调的基因有61个;氟斑牙患者组与对照组相比,差异表达基因有964个,其中有71个基因显著上调,60个基因显著下调;氟斑牙患者组与高氟负荷组比较,差异表达基因有633个,其中显著上调和下调的基因分别有15个和67个。结论多种基因与氟中毒的发生相关。

利用噬菌体抗体库筛选U251细胞血清应答基因蛋白特异抗体

利用噬菌体表面展示抗体库对不同血清处理U2 5 1细胞吸附的抗体进行差异筛选 ,筛选获得血清饥饿细胞吸附的阳性噬菌体克隆 96个和血清饥饿后恢复血清培养细胞吸附的阳性噬菌体克隆 82个。细胞免疫组化检测发现应答反应差异较大的抗体 2个 ,即血清饥饿培养细胞特异反应的抗体 1个 (11号抗体 )和血清饥饿后恢复血清培养细胞特异反应的抗体 1个 (2号抗体 ) ,其中 2号抗体在恢复血清培养细胞中的应答反应强于血清饥饿培养细胞 ,是一个血清应答基因蛋白特异抗体 ,且在血清饥饿后恢复血清培养不同时间的U2 5 1细胞中具有一定的特异性反应。该研究为寻找与细胞周期调控有关的因子奠定了基础 ,同时对肿瘤的诊断和治疗研究也有重要意义。

柑橘低氧应答基因CsHRP的克隆、亚细胞定位及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从奥林达夏橙[Citrus sinensis（L.）cv.Olinda]果萼离层中分离出1个低氧应答基因,命名为CsHRP.CsHRP基因的序列分析推测其编码98个氨基酸残基.CsHRP基因组序列与cDNA比对结果表明其含有2个内含子.Blastp分析发现,CsHRP含有保守的低氧应答保守结构域HIG_1_N,与可可、玉米、橡胶树等植物中的同源蛋白相似度达68%~81%.亚细胞定位显示CsHRP是细胞膜/细胞壁锚定蛋白.qRTPCR试验结果显示CsHRP在幼苗子叶中的表达量明显高于根、茎、叶.在逆境处理条件下,CsHRP表达受低温,高盐,PEG6000,脱落酸,乙烯,甲基茉莉酸和水杨酸诱导,说明该基因响应多种信号转导.

应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 。