改造枯草芽孢杆菌底盘细胞高效生产乙偶姻

以实验室前期保藏的经代谢工程改造的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QRC-1为出发菌株,其在5 L发酵罐平均发酵生产乙偶姻的产量达到50.7 g/L。然而,枯草芽孢杆菌存在的自溶与生长速率较慢的问题限制了其在发酵过程中的生物量增长,同时发酵产泡多的特点也影响了该菌在放大培养过程中的实时调控。因此本实验基于生理特性对枯草芽孢杆菌QRC-1进行优化改造,利用分子遗传技术开发一种新的策略,达到提高生物量和乙偶姻产量的目标。最终获得的菌株RKCR-8,比生长速率比原菌提高了30%,生物量增加了1.36倍,乙偶姻产量达到72.3 g/L。使用本研究构建的重组枯草芽孢杆菌生产乙偶姻具有更强的生产效率和工业稳定性。这一结果不仅为乙偶姻的生产提供更多参考价值,也为未来工业微生物底盘的构建提供了一种新的思路。

解脂耶氏酵母底盘细胞的工程改造及应用

基于性能卓越的微生物底盘细胞,开发高效的绿色生物制造技术,已经成为合成生物学领域的研究前沿。解脂耶氏酵母作为一种非常规产油酵母,由于其独特的生理生化特征,正迅速成为面向绿色生物制造的合成生物学研究领域的热门底盘细胞之一。近年来,围绕解脂耶氏酵母底盘细胞工程改造的研究与应用日益增多,促进了解脂耶氏酵母底盘细胞的进一步升级。本文总结了针对解脂耶氏酵母底盘细胞的工程改造策略及其在生物制造中的应用,从遗传改造技术及工具开发,基因的表达与调控策略等方面介绍各类合成生物学工具及技术在解脂耶氏酵母中的研究进展,并从底盘细胞合成高附加值产品的研究进展方面介绍了其工程改造效果。最后,对解脂耶氏酵母底盘细胞的应用前景和未来发展方向进行了展望。

微藻合成生物技术发展总结与展望:从底盘细胞到光合生物制造

光合生物制造技术是一种全新的生物制造模式,其以光合微藻为底盘,将太阳能和二氧化碳在单一过程、单一平台直接转化为生物燃料和生物基化学品,可以同时起到固碳减排和绿色生产的效果。光合生物制造技术走向工程化、规模化、产业化推广和应用,技术核心是开发生长速度快、合成效率高、工业属性强的高效能光合细胞工厂以及与之适配的过程工程技术体系,而技术取得突破的基础和关键则是优质微藻底盘细胞的开发。从微藻底盘细胞的基因组编辑和调控、微藻代谢网络的优化重塑与定向扩展、微藻光合细胞工厂工业应用属性的优化这3个层面,介绍如何应用合成生物学工具和策略开发"可编辑、可控制、可应用"的微藻底盘细胞和光合细胞工厂,进而推动光合生物制造技术在工业环境下的成功应用。

运动发酵单胞菌底盘细胞研究现状及展望

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是目前已知唯一能够在厌氧条件下利用Entner-Doudoroff(ED)途径代谢葡萄糖、果糖和蔗糖产乙醇的革兰氏阴性细菌,具有乙醇发酵速率高和对糖表观收率高、乙醇耐受性好及生物安全(generally regarded as safe,GRAS)等特点。基于合成生物学方法和代谢工程改造,可以作为纤维素乙醇及其他生物基产品生物炼制的细胞工厂。本文综述了运动发酵单胞菌独特的生理特点及其作为细胞工厂在不同领域的应用,重点介绍了构建运动发酵单胞菌作为底盘细胞,实现工业产品规模化经济生产涉及的系统生物学、合成生物学及代谢工程改造相关方法、技术与工具等方面的进展及瓶颈。同时探讨了持续开发、完善、应用高效精准的基因编辑技术、代谢途径精准时空调控方法及高通量自动筛选检测手段,在运动发酵单胞菌基因组精简优化以及生物固碳与固氮等方面取得的突破,推动合成生物学理论研究和实践应用的发展。

巴斯德毕赤酵母底盘细胞的工程化改造及应用

优质的微生物底盘宿主是实现绿色、可持续生物制造的重要平台。巴斯德毕赤酵母底盘宿主因其在蛋白表达和发酵生产中的诸多优势受到了广泛的关注和应用。而作为一种工业甲基营养酵母,其可以有效地利用来源广泛的甲醇作为唯一碳源,使其成为碳一化合物潜在的生物转化平台。近年来,随着合成生物技术和生物制药技术的快速发展,围绕毕赤酵母底盘的工程化改造研究逐渐增多,并取得了卓有成效的进展,促进了毕赤酵母底盘的发展和升级。本文简述了毕赤酵母底盘细胞的发展和应用现状,从基因操纵技术、基因表达调控、代谢工程改造等方面介绍了毕赤酵母的工程化改造策略及应用效果,总结了毕赤酵母中合成生物技术、调控元器件、新型表达平台和生物转化体系的建立与开发情况。在此基础上,进一步强调了毕赤酵母中CRISPR介导的基因编辑及调控、转录系统的重构及人工设计,介绍了其在蛋白表达和化合物合成方面的应用,并分析了其在实际应用中的优势和问题。最后,对毕赤酵母在后续研究中的底盘升级方向和应用场景进行了展望。

枯草芽孢杆菌底盘细胞的设计、构建与应用

作为一种重要的模式工业微生物和食品安全微生物,枯草芽孢杆菌在工业酶和功能营养品的生产方面具有广泛应用。近年来,随着对枯草芽孢杆菌遗传调控机制的不断揭示,多种研究策略和技术,包括基因编辑系统、基因回路、空间支架、无细胞表达系统等,被用于设计和构建枯草芽孢杆菌底盘细胞高效合成各种生物化学品。本文首先对基于基因编辑和基于内源性调控系统的枯草芽孢杆菌底盘细胞设计与构建的策略进行了系统的概述。然后,以高产N-乙酰氨基葡萄糖、七烯甲萘醌、核黄素、透明质酸和β-环糊精糖基转移酶为例介绍了枯草芽孢杆菌底盘细胞工厂的应用。最后,从基因编辑效率提升、基因回路响应信号拓展和基因组设计与重构三方面对枯草芽孢杆菌底盘细胞的设计、构建与应用进行了展望。

以分枝杆菌为底盘细胞生物合成甾药中间体的研究进展

甾体药物(steroid drugs)是一类具有重要生理和药理作用的药物。目前,甾药行业主要通过分枝杆菌(Mycobacteria)转化制备系列重要甾药中间体,再经过必要的化学修饰或酶法修饰获得高端甾体药物。较之前的“薯蓣皂素-双烯醇酮”体系具有原料廉价且来源丰富、生产成本低且反应路线短、收率高且环境友好等优点。基于基因组学和代谢组学进一步揭示分枝杆菌甾醇降解途径中关键酶系及其催化机理,使分枝杆菌作为底盘细胞成为可能。本文对不同物种类固醇转化酶的发现、分枝杆菌自源基因和异源基因过表达的改造以及分枝杆菌作为底盘细胞的优化和修饰等方面的研究进展进行了综述。

靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定

目的 利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法 采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析(NTA)和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果 酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2+肿瘤细胞均具有靶向杀伤能力。荧光显微镜观察表明,提高CD47分子的表达水平能够减弱免疫细胞对通用型CAR-Jurkat EV的吞噬作用。结论 通用型CAR-T细胞来源EV能够靶向杀伤HER2+肿瘤细胞。

工程化细胞外囊泡的设计合成与生物医学应用

近年来,细胞外囊泡因其与疾病发生发展密切相关而受到越来越广泛的关注。随着细胞外囊泡参与生命功能调控的机制被不断解析,利用细胞外囊泡作为药物载体,用于靶向治疗的工作也相继开展。细胞外囊泡作为药物载体,与人工载体相比,具有高生物相容性、低免疫原性和良好的生物膜融合能力,同时有着参与细胞通信的归巢效应等天然优势。然而,细胞外囊泡的生物医学应用也存在表面修饰复杂、包载能力差、产量较低等问题,导致使用范围严重受限。工程化细胞外囊泡是指对天然细胞外囊泡进行人工改造,使其能够特异性靶向受体细胞或组织,实现所包载功能分子的精准递送,并支撑可放大生产的模式,从而展现出广阔的生物医学应用前景。合成生物学技术的引入,可实现底盘细胞的从头设计再造,支撑细胞外囊泡的标准化、模块化合成。本文首先概括了工程化细胞外囊泡的表面修饰、工程化细胞外囊泡的功能分子包载的方法和应用;其次总结了工程化细胞外囊泡的生产制备,如提升细胞外囊泡产量的工程化策略、细胞外囊泡的放大生产与提取纯化等;最后展望了合成生物学通过改造底盘细胞基因组、人工设计囊泡表面蛋白、调控分子包载的细胞过程等定制化合成细胞外囊泡的前景。合成生物学技术的发展与使用可推动工程化细胞外囊泡的定制化设计与合成,将进一步精细控制其属性、提升其效能、拓展其应用,争取将其早日广泛应用于人类健康事业。

7-脱氢胆甾醇合成功能模块与底盘细胞的适配性

利用合成生物技术生产7-脱氢胆甾醇的挑战性在于获得合成功能模块与底盘细胞的适配关系。从更换不同调控强度的启动子和不同改造的酵母底盘两方面,对二者的适配性进行研究,以增加7-脱氢胆甾醇产量:过表达酵母固醇合成途径中的内源基因tHMGR和ERG1,敲除非必需基因ERG6和ERG5以抑制酵母固醇向麦角固醇的转化,得到改造后的酵母底盘SyBE_000956;利用由强到弱依次为TDH3p、PGK1p和TDH1p的启动子,引入人源C-24还原酶基因DHCR24,构建3种强度的外源功能模块,并分别导入3种底盘中,得到9种人工合成细胞。结果表明,TDH3p调控的功能模块与底盘细胞SyBE_000956具备较好的适配性,实现7-脱氢胆甾醇产量的提高。为后续的适配性研究提供了理性设计的依据。

链霉菌底盘细胞的开发现状及其应用

天然产物及其衍生物在现代医疗中扮演着举足轻重的角色,其生物活性多样性以及化学结构的丰富性是新药研发的源泉和动力。利用纯化学方法合成天然产物在技术和成本上有很大的困难,加上许多天然产物的原始产生菌具有培养条件苛刻、产量低下等缺点,而且大量基因簇在原始菌株中是沉默的,这使得利用合成生物学思想来指导天然产物生物合成基因簇的异源表达具有重大意义。作为抗生素、抗肿瘤活性物质、免疫抑制剂等次级代谢产物主要来源的放线菌一直是研究者们关注的焦点,特别是随着基因测序技术的飞速发展,人们发现链霉菌基因组中包含着极为丰富的天然产物生物合成基因簇资源。这意味着开发链霉菌底盘细胞作为异源表达宿主有其得天独厚的优势。本综述从底盘细胞开发的意义入手,重点阐述链霉菌底盘细胞构建的策略及现状,随后通过实例阐述了各种底盘链霉菌的实际应用。

合成生物学时代基于非模式细菌的工业底盘细胞研究现状与展望

工业微生物底盘细胞的开发将为工业生物技术的发展提供优良的细胞工厂,有利于实现环境保护及经济可持续发展。基于合成生物学"设计-构建-测试-学习"(Design-Build-Test-Learn,DBTL)策略,对底盘细胞进行多维度的理性或半理性改造是实现"建物致知"以及"建物致用"目标的重要手段。文中简述了合成生物学DBTL策略中各步骤相关的重要技术方法;概述了部分重要模式微生物底盘细胞的策略与研究进展;重点比较介绍了工业生物技术领域具有特殊生理功能、利用一碳化合物及高效生产平台化合物的部分非模式细菌;同时也提出了实现优良、安全合成微生物细胞工厂构建与应用的策略。这些方法策略包括依靠合成生物学技术方法,综合模式与非模式微生物优势,开发应用经济、高效的高通量智能装备,建立分子组学与表型组学研究平台,推动多层次系统生物学与表型组学大数据的解析、整合、模拟与可视化,以及建立高质量的数字细胞模型和基因组优化的底盘细胞,推动高效、优良工业细胞工厂的理性设计、构建与应用。

利用不同底盘细胞开展生物合成萜类化合物的研究进展

萜类化合物种类多样,且具有独特的生理功能和应用价值,在药物研发、食品工业以及新型生物燃料等方面存在巨大的开发潜能。目前生产复杂萜类化合物的效率较低,传统的植物提取和化学合成法不适于大规模工业生产,而近年来新兴的合成生物学方法能够在一定程度上提高萜类产量,在一些萜类化合物的实际生产研究中已经取得不错的成果,成为研究的热点。文章总结了一些成功利用合成生物学手段提高萜类合成量的经验,以不同的底盘细胞的研究进行阐述,为进一步开发萜类化合物生物合成途径提供了依据。

蓝藻细胞工厂的研究进展

蓝藻固碳能力强、易于进行遗传操作,是开发绿色生物技术产品的理想细胞工厂。但长期以来,许多研究成果仍处于实验室阶段,各种化学品生产的效率较低。结合蓝藻自身优势,充分利用现代生物技术手段,将有助于促进蓝藻细胞工厂的深入研究和发展。以蓝藻生物技术发展过程为主线,分别介绍了基因工程、代谢工程及合成生物学在蓝藻细胞工厂研究中取得的成果,并指出“药食同源”是蓝藻表达外源药物蛋白,实现成果转化的发展方向;开发先进的合成生物学工具,改造、设计和重构蓝藻底盘细胞代谢途径,是实现化学品高效生产的必由之路。期望为蓝藻生物技术相关问题的深入研究提供参考。

自动化合成生物技术在DNA组装与微生物底盘操作中的应用

基于绿色生物制造进行物质能量生产,有望减少对天然植被、耕地、石化等资源的依赖,而微生物细胞工厂是绿色生物制造过程的“芯片”。合成生物学为微生物细胞工厂的研究提供了重要的使能技术,但目前仍面临生命系统高度复杂、实验过程需要反复试错、实验通量较低等限制因素。自动化合成生物技术借助高通量、自动化和智能化的软硬件设施平台,基于标准化、模块化的生物元件库和合成生物工艺,可低成本、高通量、快速、多循环地完成海量工程试错性实验,加速特定性能人工细胞工厂的设计和优化,支撑相关研究和应用。本文主要针对细胞工厂“设计-构建-测试-学习”循环中最关键、最耗时的“构建”环节,对DNA组装和底盘细胞操作自动化工艺和设施平台进行了总结,对自动化合成生物技术应用于生物合成基因簇挖掘、代谢通路优化和底盘细胞优化的最新进展进行了介绍。最后展望了微生物细胞工厂自动化构建面临的挑战和未来发展,讨论了包括非模式微生物在内的全流程自动化的发展趋势,而自动化装备的国产化自主研发将为此做出重要贡献。

基因组再造与重排构建细胞工厂

细胞工厂能利用微生物细胞制备人类所需能源、药物和化学品。底盘细胞和外源代谢路径的适配是构建高效细胞工厂的核心难题。基因组再造指利用化学合成的核苷酸分子“自下而上”构建生物基因组,基因组诱导重排指通过在全基因组尺度进行DNA序列与结构的人为调控。基因组再造和诱导重排实现了对生命体的创造,增强了模式底盘细胞的遗传稳定性和操作柔性。基因组的适度精简和密码子简化改善细胞对底物、能量的利用效率,提高细胞生理性能的预测性和可控性。基因组重排可诱导染色体发生随机删除、复制、移位和倒置等结构变异,可产生大量性状优良的模式底盘细胞,进而加速代谢路径优化,提高路径和底盘细胞的适配性,为人工细胞工厂快速构建和优化提供了新策略。

“双碳”背景下聚球藻底盘研究的挑战与机遇

CO_(2)是最主要的温室气体,也是储量丰富的碳资源。发展CO_(2)的高效资源化利用技术可缓解迫切的能源和环境压力,是实现“双碳”目标的重要途径。蓝细菌可通过光合自养的方式将CO_(2)转变为有机物,是开发光驱动细胞工厂并直接利用CO_(2)生产化合物的主要微生物底盘。聚球藻作为蓝细菌的典型代表,生长快、遗传背景清楚、营养需求低,是目前光驱动合成生物学的热门底盘。在当前“碳达峰”和“碳中和”的“双碳”背景下,聚球藻底盘的研究正迎来前所未有的机遇。本文从自然进化、地球物理局限、土地气候依赖、太阳能转化效率等角度探讨了蓝细菌底盘开发的理性和机遇;分析了其在能源生产、化合物制造和碳汇与碳捕集中的应用潜力和愿景;从碳固定、光能捕捉和生物多样性的层面讨论了蓝细菌的代谢潜能。在上述基础上,系统综述了基因编辑、适应性进化、多元抗逆和光驱动细胞工厂这些蓝细菌合成生物学的热点研究领域近期的重要研究进展,并对当前所面临的挑战与难题进行了梳理,分析提出了可行的应对策略。对这些问题和挑战的深入探索有望推动光能捕获、固碳、抗逆、代谢网络重编等方面研究的突破,开发出超越自然进化的高效光合底盘,并最终建造高版本的光驱动细胞工厂,助力“双碳”目标的实现。

乳酸克鲁维酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)是一种典型的非常规酵母,在微生物基础研究和应用研究方面都有着非常重要的用途。该酵母具有食品安全级别高、蛋白分泌能力强、整合表达能力高效及大规模发酵能力优异等特点,因此,工业应用前景较为广阔。目前,乳酸克鲁维酵母作为蛋白表达系统已在食品和医药等行业中得到了广泛应用。近年来,国内外生物技术领域的科研人员以乳酸克鲁维酵母作为底盘细胞,利用合成生物学技术已经成功构建出了能够生产各种生化产品的微生物细胞工厂,该技术展示出了极大的发展潜力。本文主要对乳酸克鲁维酵母的菌种特点、合成生物学元件、遗传操作工具、基因编辑策略进行介绍,并综述乳酸克鲁维酵母作为细胞工厂的应用研究进展,可以为今后利用合成生物学方法在乳酸克鲁维酵母底盘中构建生产各种高附加值产品的高效微生物细胞工厂提供理论指导。

合成生物技术驱动酪丁酸梭菌细胞工厂开发的研究进展

作为一种重要的工业微生物和新型益生菌,酪丁酸梭菌是厌氧条件下代谢多种底物产生丁酸的优势菌株,在其他精细化学品生产和大健康领域亦具有广泛应用。然而,获取生产效率高、鲁棒性强的高版本酪丁酸梭菌细胞工厂,仍然面临着遗传转化效率低、遗传操作工具有限、调控手段单一等诸多挑战。近年来,随着合成生物学的不断发展和酪丁酸梭菌生物信息数据的逐步完善,多种研究策略和技术,包括基因编辑系统等,被用于设计和构筑酪丁酸梭菌底盘细胞高效合成各种精细化学品。本文首先对酪丁酸梭菌独特的生理特性进行了概述。然后,对酪丁酸梭菌底盘细胞改造过程中涉及的系统生物学方法以及遗传操作工具的构建方法与技术进行了总结。同时,探讨了酪丁酸梭菌中多类型代谢调控策略以及群体感应系统的开发及其在合成精细化学品中的应用。最后,从遗传转化效率提升、基因编辑工具拓展、基因回路设计与重构高通量筛选平台建立、一碳气体利用等方面对酪丁酸梭菌底盘细胞的创制进行了展望。

底盘-回路耦合:合成基因回路设计新挑战

随着合成生物学研究领域的发展以及对人工生命系统设计复杂程度的需求增加,合成基因回路设计呈现复杂化、规模化的发展趋势,导致合成基因回路行为变得难以预测。传统的基因回路设计框架注重回路内部元件作用关系的刻画和元件自身性能的参数调试,通过大量的试错,使回路功能达到次优化。近年来大量的工作表明,基因回路和底盘细胞存在难以避免的耦合:合成回路的基因表达受底盘细胞的资源调配机制调控,而合成基因回路的表达消耗底盘细胞的资源。这种相互作用往往导致底盘细胞生理状态的改变并影响回路功能。因此,将底盘细胞生理参数纳入到基因回路的设计框架中将有望提高基因回路设计的可预测性,提高理性设计能力。面对底盘-回路耦合带来的设计挑战,近年来,涌现出了大量基因回路正交化、模块化的设计思路,成功减弱或规避耦合效应。本文回顾了近年来微生物细胞生理与基因回路的相互作用机制研究的进展;进一步介绍了两类生物物理模型的建立思路,展现物理模型如何帮助我们理解、预测和评估底盘-回路耦合带来的效应;总结了模块化和正交化的设计范式,展现了它们对解决底盘-回路耦合效应的潜力。随着基因“读-改-写”能力提升,以及自动化实验的大规模应用,未来基因线路的设计应当着重于以下几个方面:①高质量元件挖掘;②高质量定量数据刻画;③多维度组学数据的整合,全面评估底盘细胞-基因线路作用程度;④精准的模型预测框架建立。