泡桐丛枝植原体16S rDNA和延伸因子基因序列分析

对采自陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省的泡桐丛枝病材料,利用巢式扩增,均得到16S rDNA基因片段约1.2kb;扩增得到植原体延伸因子(EF-Tu)tuf基因,长度约为850bp.。通过将16S rDNA基因片段和延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列与已知植原体16Sr各组成员进行同源性比较,确定我国大陆泡桐主栽区陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省与已经报道的台湾省泡桐丛枝植原体基本一致,均为同一个种,没有株系的分化,全部归属于植原体16SrI-D组,从而确定了其分类地位。

小麦蓝矮病植原体延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列的同源性分析

目的利用分子生物学方法分析小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因,从亚组水平上确定小麦蓝矮病植原体的分类地位。方法电镜观察自然发病的小麦蓝矮病病叶;用引物fTufu/rTufu对小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因进行PCR扩增;核苷酸序列测定及分析。结果经电镜超微结构观察,在韧皮部观察到大量典型植原体。通过PCR扩增得到约850bp的特异片段。感受态转化后,进行测序,结果表明小麦蓝矮病植原体tuf基因片段长842bp,编码280个氨基酸。分析比较15种植原体延伸因子tuf基因的同源性,结果表明小麦蓝矮病植原体与三叶草绿变(KVF)亲缘关系最近,核苷酸同源性为99.9%,氨基酸同源性为100%。结论从亚组水平上确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位,为研究小麦蓝矮病植原体的来源及致病分子机理提供理论依据。

山东蚕区桑黄化型萎缩病病原物的分子鉴定

以采自山东省宁阳市桑园的桑黄化型萎缩病发病植株叶脉组织为材料,通过PCR扩增植原体16S rRNA基因及延伸因子基因(tuf)和核糖体蛋白基因(rp),分别得到大小约为1.4、0.8和1.2 kb的目的片段并测定序列。以该病原物的16S rRNA基因与GanBank中相关的植原体16S rRNA基因序列构建系统发育树并进行RFLP分析,结果显示该病原物属于翠菊黄化组的16SⅠr-B亚组,与翠菊黄化组16SⅠr-B亚组典型成员的同源性为99.9%。进一步对延伸因子基因和核糖体蛋白基因构建系统发育树并做RFLP分析,结果显示该病原物与翠菊黄化组的tuⅠf-B亚组典型成员和rpⅠ-B亚组典型成员的同源性分别达到99.6%、99.9%。由此在3个基因水平确定该植原体的分类地位属于16SrⅠ-B、tuⅠf-B和rpⅠ-B亚组。

引起玉米穗腐病的禾谷镰刀菌LAMP快速检测方法的建立

针对引起玉米穗腐病的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),根据翻译延伸因子基因(EF-1alpha)的保守区域设计特异性引物,通过优化反应时间和温度,建立一种灵敏、快速的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并对优化的F.graminearum LAMP反应体系进行特异性、灵敏度及可行性检测。结果表明,该LAMP方法能够有效检测禾谷镰刀菌的基因组DNA,64℃、45min为最优反应条件。在最佳条件下,该方法对禾谷镰刀菌具有良好的特异性,检测灵敏度可达到100pg/μl。该检测方法为禾谷镰刀菌引起的玉米穗腐病的田间快速诊断及病原菌监测奠定了基础。

从浙江蚕区桑园发生桑黄化型萎缩病植株分离植原体的分子鉴定

从浙江省蚕区的桑园内采集表现桑黄化型萎缩病症状的植株叶片,并提取叶脉总DNA,通过巢式PCR和常规PCR方法对桑黄化型萎缩病植原体分离物(MYD-ZJ)的16S r DNA、延伸因子基因tuf和核糖体蛋白基因rp进行扩增及克隆,分别得到大小为1 239 bp、842 bp和1 240 bp的序列。对这些基因片段序列进行系统进化分析,结果表明,MYD-ZJ的16S r DNA序列与来自山东、安徽等省感病桑树分离桑黄化型萎缩病植原体的同源序列的相似度为98%,在进化树中位于同一进化支;MYD-ZJ的tuf基因序列与来自山东省的桑黄化型萎缩病植原体的同源序列的相似度为89%~100%,并与该同源序列以及同样来自山东省的枣疯病植原体、苦楝丛枝病植原体等聚为一支;MYD-ZJ的rp基因序列与来自山东省、安徽省的桑黄化型萎缩病植原体的同源序列的相似度为100%,在进化树中位于同一进化支。研究结果明确了MYD-ZJ属于翠菊黄化植原体组的16SrⅠ-B亚组、tufⅠ-B亚组及rpⅠ-B亚组。

生防长枝木霉菌培养特性及形态学与系统发育学鉴定

采用宏观观察法和显微镜镜检的方法,在PDA和MEA培养基上对1株自我采集的具有生防价值的木霉菌株T05进行了培养特性和形态学研究。结果表明：该菌株在PDA平板培养基上生长较快,产分生孢子较早且多,也能产生厚垣孢子;在MEA上能产生分生孢子,但不产生厚垣孢子。该菌株产孢簇为松散羊毛状到紧实的疱状结构;分生孢子梗具有较简单的分枝系统,通常呈直角的1～2次分枝,单生或有时成对。瓶梗不规则地在侧面分布,时常单生,安瓿形或柱形,基部常缩缢但不明显;分生孢子单细胞、长方形到椭圆形、绿色、光滑,大小为（2.0～3.0）μm×（2.0～6.0）μm。根据这些形态特征将菌株T05鉴定为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。在此基础上,对T05的r DNA转录间区序列ITS和翻译延伸因子基因tef1-α的第5内含子序列进行了扩增、测序。系统发育学的研究表明,该菌株的ITS序列和tef1-α的第5内含子序列与长枝木霉的多个菌株都具有最大的相似性,因此属于长枝木霉。

许昌泡桐丛枝病植原体的分子鉴定

对采自河南许昌的表现丛枝症状的泡桐样品进行了病原鉴定,并通过序列同源性分析确定了其分类地位。采用16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的通用引物fTufu/rTufu,对样品总DNA进行PCR扩增,分别得到了约1.2kb和840bp的特异条带。经克隆测序,并在NCBI网站比对分析,确定所得序列分别为植原体特定的16SrDNA和tuf基因序列。将测得序列与已报道的翠菊黄化组植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,显示河南许昌的泡桐丛枝病植原体属于16SrⅠ-D亚组。

大豆根腐病致病镰孢菌的多重PCR检测技术

为建立大豆根腐病镰孢菌的多重PCR检测方法,以四川大豆根腐病致病菌包括尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、禾谷镰刀菌和木贼镰孢菌为对象,设计镰孢菌翻译延伸因子基因EF-1α的种特异引物,建立多重PCR扩增体系,并进行优化与验证。结果表明:25μL体系为最优镰孢菌多重PCR扩增体系,4种镰孢菌等体积混合DNA 4.0μL,各镰孢菌特异正向引物1.0μL,共用反向引物4.0μL,最佳退火温度为54℃,当循环30次时,能清晰地扩增出各镰孢菌EF-1α条带,对4种镰孢菌混合DNA的检测灵敏度可达0.1 ng/μL。室内环境样本验证结果表明,依据EF-1α扩增片段大小,该体系能够特异地检测出大豆黄化苗与致病镰孢菌混合样本中的镰孢菌,但无法从其它真菌的DNA中扩增获得目的片段。表明基于EF-1α基因特异引物建立的镰孢菌多重PCR检测技术可快速、特异地检测大豆根腐病镰孢菌。

大蕉枯萎病病原菌鉴定及TEF-1α序列分析

近年来,大蕉枯萎病在广东省东莞市发生严重,为了有效控制病害发生蔓延,生产上急需明确大蕉枯萎病的病原。本研究收集了我国华南地区的12株大蕉枯萎病病原菌及19株包括1号及4号生理小种的单孢菌株,以来源于澳大利亚的1号、2号、3号和亚热带4号生理小种以及4株非病原尖孢镰孢菌作对照,通过病原菌形态鉴定、致病性测定、4号小种(Foc 4)及热带4号小种(TR4)的分子特异检测、以及基于翻译延伸因子(TEF-1α)序列的系统发育分析,对大蕉枯萎病病原菌进行鉴定。同时,对我国华南地区不同来源的香蕉枯萎病病原菌的遗传发育关系及致病性分化情况进行了研究。结果表明:(1)引起大蕉枯萎病的病原菌主要是1号生理小种或者是与1号生理小种亲缘关系较近的一个新的系统发育谱系,该谱系可能为1号生理小种变异演化而来;(2)大蕉枯萎病病原菌对大蕉和粉蕉都有较强的致病力,但不能侵染香蕉;我国的1号小种存在一定的分化,其中有一个类群只能感染粉蕉,另一个类群既能感染粉蕉也能感染大蕉;(3)大蕉与粉蕉枯萎病的病原菌在致病性及遗传发育关系上都存在一定的交叉和分化。