植酸酶phyA^m基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyAm重组于大肠杆菌表达载体pET30b(+),以重组表达载体pET30bFphyAm为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyAe(在植酸酶基因C端增加了来源于pET30bFphyAm载体上13氨基酸残基)。含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAe在GS115酵母中表达。纯化的突变酶PPNPe与野生型酶PPNPm8相比:PPNPAe的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高21%,比活力略有提高。最适反应pH为5.6,有效pH范围pH4.6到pH6.6。比未突变酶扩大了0.4单位。

过氧化氢酶Ⅰ结构延伸突变改善酶热稳定性的初步研究

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶Ⅰ及其取代突变酶８８（２５）的延伸突变是指在酶蛋白的Ｃ末端上连接一段随机肽链，从而改变了酶蛋白的结构．研究结果表明，这种延伸突变的方法非常有效地提高了酶的热稳定性，并且随机肽链的疏水性与其对应的延伸突变体酶的热稳定性呈现一定的负相关性，即随机肽链的疏水性越高。

黑曲霉植酸酶phyA^m基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyAm重组于大肠杆菌表达载体pET-30b(+),导入大肠杆菌BL21(DE3)。构建的工程菌BL21-pET-30b-FphyAm,实现了植酸酶的融合表达,表达产物的植酸酶活性为419.4 U/mL。SDS-PAGE分析表明,pET-30b-FphyAm经IPTG诱导3 h后,表达产物达到最高表达量,占细胞可溶性总蛋白量的10.47%,分子量为52.64 kD。该表达系统可作为研究黑曲霉植酸酶体外改良的工具。

基因体外随机突变的两种方法的研究

引导蛋白质功能进化常用的方法是模拟和加速蛋白质基因自然重组的进程 ,即在蛋白质的基因中引进随机突变。因此 ,蛋白质基因体外随机突变的方法影响着引导蛋白质功能进化的效果。本文描述两种简单而有效的基因体外随机突变发生方法。一种是化学诱变法 :将蛋白质基因用1.0mol/L硝酸钠在室温下处理1h,然后将突变基因插入质粒 ,导入大肠杆菌中表达 ;另一种方法是延伸诱变法 :将10个随机氨基酸短肽基因连接到蛋白质基因上 ,使蛋白质C末端连接随机短肽 ,通过增大蛋白质分子来达到延伸蛋白质序列空间的目的。来自嗜热脂肪芽孢杆菌的过氧化氢酶I基因用这两种方法进行了随机突变 ,获得了大量突变体酶基因。通过对突变体酶基因表达产物性质变化的测定 ,证明这两种基因诱变方法能够有效地诱发基因的随机突变。

用于蛋白质体外分子进化研究的DNA随机突变技术

蛋白质体外分子进化是模拟自然的进化过程，利用基因随机突变和定向筛选（选择）技术，以获得具有预期新功能的突变体分子。虽然体外进化近几年才产生，但已成为医药和工业领域中筛选具有特殊催化性质的酶的最重要的方法之一。ＤＮＡ随机突变技术是蛋白质体外分子进化研究的基础，本文将对几种最重要的突变方法：倾向错误的ＰＣＲ、ＤＮＡ重排、模板交错延伸反应和随机延伸突变的原理和应用等加以介绍。

河南省8个家系β地中海贫血基因突变类型检验

目的 探讨河南省β地中海贫血 (β地贫 )基因突变类型及其基因诊断方法。方法 综合应用MOEA及巢式PCR等新技术 ,设计了针对中国人β地贫最常见的 5种基因突变的检测方法。 结果 完成了河南籍 8个家系成员的基因筛查诊断 ,14条β地贫阳性染色体的检测结果为IVS -Ⅱ -65 4(C→T) 5条 ,CD41-4 2 (-TTCT) 3条 ,TATAbox -2 8/-2 92条 ,CD17(A→T) 2条 ,另 2条染色体突变性质不清。检出率达 85 7%。对 2例高危胎儿作了产前诊断 ,基因型分别为IVS -Ⅱ -65 4/A和CD41-4 2 /A ,建议继续妊娠 ,经产后取材验证 ,结果与产前诊断一致。结论 提示河南省β地贫基因突变的种类与频率和我国南方诸省基本相同 ;应用本文设计的方法可对 90 %以上中国人