生物活性肽的制备方法及其功能

一、生物活性肽的制备方法1.化学合成法制备活性肽。美国化学家于1963年创建了经典的固相多肽合成法并因此获得1984年诺贝尔化学奖。该法主要是将带有氨基保护基的氨基酸的羧基端固定到不溶性树脂上,脱去该氨基酸上的氨基保护基,同下一个氨基酸的活化羧基形成酯键,从而延伸肽链形成多肽。多肽固相合成法经过不断的改进和完善,已经广泛用于多肽和蛋白质的研究领域,尤其是短肽的合成。

RIPK3基因转染的SH-SY5Y细胞中HIF-1α基因及其信号通路相关基因表达变化

目的观察受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)基因转染的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中低氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA及其信号通路相关基因表达变化。方法构建表达RIPK3基因的p CMV6-AC-GFP质粒(重组质粒),培养SH-SY5Y细胞,分为实验组及对照组,分别转染重组质粒和空载质粒。采用Western blotting法检测细胞中的RIPK3蛋白,分别于培养8、14、20、26、32、38 h后,通过MTT实验检测细胞增殖情况(OD值)。采用转录组测序技术(RNAseq)及Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件检测并筛选RIPK3-HIF1α下游信号通路中的关键基因。采用微滴式数字PCR(dd PCR)检测两组细胞中的HIF-1αmRNA。结果实验组细胞中RIPK3蛋白相对表达量(0.806±0.097 5)高于对照组(0.455±0.088 6),P<0.05。随培养时间延长,实验组细胞增殖受到抑制。实验组细胞中HIF-1αmRNA相对表达量(0.015 43±0.003 47)低于对照组(0.046 28±0.010 26),P<0.05。在HIF-1α为核心的相互作用关系网络中,筛选出关键分子泛素缀合酶样蛋白(UBC)、希佩尔-林道蛋白(VHL)、转录延伸因子B多肽1(TCEB1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。结论 RIPK3基因转染SH-SY5Y后,细胞中HIF-1αmRNA表达下调,同时HIF-1α信号通路相关基因(UBC、VHL、TCEB1、VEGFA)的表达水平受到影响。

前列腺癌DU145细胞增殖和克隆形成与延伸因子1α基因表达的关系

目的探讨延伸因子1a（EF-1α）基因表达与前列腺癌细胞株DU145细胞增殖、克隆形成等功能的关系。方法DU145细胞株分3组：对照组（未转染siRNA），转染对照组（转染随机siRNA）和实验组（转染EF-1α—siRNA）。应用RNA干扰技术特异性调低DU145细胞株EF-1α蛋白质水平，并通过蛋白质印迹法验证。应用体外细胞功能分析技术，比较EF-1α蛋白质水平调低后DU145细胞增殖、克隆形成能力的变化和差异。结果应用RNA干扰技术实现了特异性调低前列腺癌细胞株DU145中EF-1α的水平。转染随机siRNA不影响DU145细胞中EF-1α蛋白质水平。调低DU145细胞EF-1α蛋白质水平后，实验组DU145细胞第4～7天增殖率较对照组下降45．9％、53．5％、35．3oA和38．1％（P〈0．05）。实验组DU145细胞形成克隆数较对照组减少67．0％（P〈0．01）。结论调低EF-1α表达水平对前列腺癌细胞增殖、克隆形成等肿瘤相关生物学行为产生负面影响。Ep-1α基因在前列腺癌靶向治疗中可能成为适当的靶基因。

静默人类真核延伸因子1A2对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的探讨静默人类真核延伸因子1A2（EEF1A2）对胰腺癌细胞体内生长的影响及其可能的机制。方法建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，均分为空白组、阴性对照组、EEF1A2组，移植瘤内分别注射PBS、阴性对照siRNA和特异性EEF1A2siRNA。测定各组移植瘤的体积和质量；应用免疫组织化学的方法检测各组移植瘤组织中EEF1A2和抗增殖细胞核抗原抗体（PCNA）的表达；应用TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡率。结果在裸鼠移植瘤模型中，从给药后第17天开始，EEF1A2组移植瘤体积增长明显滞后于阴性对照组和空白组（P值均〈O．05）。治疗结束后切取肿瘤称重，EEF1A2组肿瘤质量为（0．27±0．06）g，显著低于阴性对照组和空白组[（0．39±0．08）g和（O．43±0．07）g，P〈0．05]。EEF1A2主要表达于胰腺癌细胞胞质，其中在阴性对照组和空白组中，阳性细胞分布比较密集，阳性率分别为（72．58±25．47）％和（76．75±23．19）O，而EEF1A2组阳性细胞分布较稀疏，阳性率为（34．78±21．36）％，差异有统计学意义（P〈0．01）。EEFIA2组的PCNA蛋白表达也显著低于空白组和阴性对照组（P〈O．01），而原位末端转移酶标记技术（TUNEL）的结果显示EEF1A2组中细胞凋亡率高于空白组和阴性对照组（P〈0．01）。结论EEF1A2在体内能被有效静默，EEF1A2静默后能明显抑制胰腺癌细胞的生长，可能与其抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关。

我国中原地区653株真菌性角膜炎分离镰刀菌的基因型及药物敏感性

目的 研究中原地区真菌性角膜炎分离镰刀菌的基因型和体外药物敏感性.方法 测定2002-2011年河南省眼科研究所真菌性角膜炎患者角膜分离的镰刀菌758株的部分translation elongation factor （EF）1-a基因序列,通过部分EF1-α基因的序列比对进行镰刀菌菌种和基因型的鉴定.采用美国临床实验室标准研究所M38-A方案测定其中145株镰刀菌对伏立康唑、特比萘芬、那他霉素等12种药物的最低抑菌浓度（MIC）.结果 653株镰刀菌菌种及基因型通过EF1-α序列得到鉴定.中原地区真菌性角膜炎感染镰刀菌以腐皮镰刀菌种复合体（FSSC）最多,386株（59.11％）,包括15个种,43个基因型,最常见的FSSC基因型是FSSC5-d（132/20.21％）.赤霉菌种复合体（GFSC）居第2位,包括3个菌种,F.proliferatum 124株（18.99％）,F.verticillioides 112株（17.15％）和GFSC18株（2.76％）.尖孢镰刀菌复合体（FOSC）居第3位,11株（1.68％）,6个基因型.体外药物敏感试验结果显示镰刀菌属对那他霉素、伏立康唑、两性霉素B敏感,对氟胞嘧啶、氟康唑、制霉菌素、克霉唑、咪康唑耐药.超过一半的镰刀菌对益康唑、酮康唑、伊曲康唑和特比萘芬敏感.FSSC对伏立康唑、咪康唑、特比萘芬、益康唑和那他霉素的MIC50高于F.verticillioides、F.proliferatum和GFSC.结论 中原地区真菌性角膜炎感染镰刀菌大多数位于3个复合体FSSC、GFSC和FOSC内,基因型（种）多.不同种镰刀菌对伏立康唑、咪康唑、特比萘芬和那他霉素的药物敏感性有差异.

靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭

目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2(homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制。方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平。将EEF1A2-小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p-Akt和总Akt蛋白的表达变化。结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达。EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P<0.01)。EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P<0.05)。EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P<0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P>0.05)。结论:siRNA干扰下调EEF 1A 2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关。